对中间马蹄蝠（Rhinolophus affinis）器官的单细胞分析揭示了病毒感染及抗病毒免疫特征

《BMC Genomics》：Single-cell analysis of intermediate horseshoe bat (Rhinolophus affinis) organs reveals viral infections and antiviral immune signatures

病毒携带与免疫应答平衡：果蝠Rhinolophus affinis肺组织单细胞转录组分析显示感染八种病毒（包括七种逆转录病毒）及三种病毒，感染细胞激活蛋白质合成、组织修复和免疫应答相关通路，巨噬细胞中CD14、CD74、MRC1等基因表达升高（免疫激活模块）；SAMHD1、SLC11A1等基因表达上调（抗病毒模块）。跨物种比较发现该果蝠肺巨噬细胞特有高表达IRF9、DDX5等促炎基因及IRF2、PTPRE等抗炎基因，并通过vacuolar acidification和抑制外部刺激响应等机制平衡免疫反应。

　　这项研究聚焦于蝙蝠肺部和肾脏中的病毒表达情况，特别是以“大耳蝠”（Rhinolophus affinis）为对象，探索其在病毒感染下的免疫反应机制。蝙蝠作为多种病毒的天然宿主，包括冠状病毒、狂犬病毒和埃博拉病毒等，但它们通常不会表现出明显的疾病症状。这种独特的免疫耐受能力使其成为研究病毒与宿主相互作用的重要模型。通过单细胞转录组学技术，研究者能够深入解析蝙蝠体内不同细胞类型在病毒感染下的基因表达模式，从而揭示其免疫系统如何在不引起严重病理反应的情况下控制病毒复制。

在研究过程中，科学家们使用了Viral-Track这一计算工具，用于检测病毒RNA并根据转录组特征对感染细胞进行分类。与传统的单细胞RNA测序流程不同，Viral-Track不仅能够识别未对齐到宿主基因组的读取数据，还能将这些数据重新对齐到高质量的病毒基因组数据库中，从而更全面地捕捉病毒的存在和活动。这种方法在多个感染模型中表现出高灵敏度，包括新冠病毒感染、慢性乙型肝炎和γ疱疹病毒感染。此外，研究还结合了Kraken2这一基于k-mer的分类工具，以补充病毒序列的检测，特别是在低丰度病毒检测方面提供了额外的验证手段。

研究团队从中国国家基因库数据库中获取了R. affinis的单细胞转录组数据，包括原始FASTQ文件和带有细胞类型注释的基因表达矩阵。这些数据覆盖了蝙蝠的七个器官，其中肺部和肾脏的病毒信号最为显著。肺部的病毒负载达到3.199%，远高于其他器官。通过对这些数据的分析，科学家们发现了八种病毒的表达信号，包括七种逆转录病毒（如HERV-K113、BEV-M7和AMLV）和一种非逆转录病毒（如SV40）。相比之下，肾脏中检测到的病毒种类较少，仅包括HERV-K113、BEV-M7和SV40。这些结果表明，蝙蝠肺部可能是其体内病毒活跃的主要场所。

研究进一步分析了感染细胞在肺部不同细胞类型中的分布情况，发现感染细胞广泛存在于各种肺部细胞中，但未见于纤毛细胞。这表明蝙蝠肺部的免疫系统能够有效识别并应对多种病毒，同时避免对特定细胞类型造成破坏。感染细胞在多个通路上表现出激活特征，包括蛋白质合成、组织修复和免疫反应相关通路。这些通路的基因表达水平显著升高，暗示蝙蝠肺部可能具备某种机制来维持免疫反应的平衡，防止过度激活导致的组织损伤。

在细胞间通讯（CCI）分析方面，研究发现病毒感染显著改变了肺部细胞之间的信号传递模式。感染细胞之间的相互作用比未感染细胞之间更加频繁且强度更高，尤其是在成纤维细胞和增殖性T细胞中。这些细胞通过增强的配体-受体相互作用，与周围细胞建立了更复杂的信号网络，可能有助于蝙蝠在病毒感染过程中协调免疫反应，同时避免免疫系统的过度反应。例如，感染的成纤维细胞与AT1细胞和上皮细胞之间存在显著的信号交换，可能促进组织修复和纤维化过程。而感染的T细胞则通过与上皮细胞的相互作用，参与了免疫调节和上皮细胞再生，表明蝙蝠的免疫系统能够以一种精细的方式调控感染过程。

为了进一步理解蝙蝠肺部的抗病毒机制，研究团队进行了基因模块分析，发现两个与免疫相关的重要基因模块。模块3主要与免疫细胞激活和免疫反应相关，其中包含CD14、CD74和MRC1等关键基因。这些基因在免疫识别和炎症反应中发挥重要作用，可能帮助蝙蝠在面对病毒感染时快速调动免疫资源。模块8则与抗病毒功能密切相关，其中SAMHD1、SLC11A1、TYROBP和IL18等基因的表达水平显著上升。SAMHD1在新冠病毒感染中已被证实具有抑制病毒复制的作用，这可能解释了其在蝙蝠肺部的高表达。此外，这些基因的表达模式与蝙蝠肺部的免疫细胞特征密切相关，尤其是在肺部巨噬细胞中表现突出。

研究还进行了跨物种比较，将R. affinis的肺部数据与人类、小鼠和恒河猴等物种进行对比，发现R. affinis肺部巨噬细胞在多个通路中表现出独特的表达特征，包括与溶酶体酸化和对外部刺激的负调控相关的通路。这些通路在蝙蝠肺部巨噬细胞中富集，可能在维持免疫稳态方面发挥关键作用。此外，研究还发现R. affinis肺部巨噬细胞中，一些促炎性基因（如IRF9、DDX5、IL6ST、ITGA4和CSF1）以及抗炎性基因（如IRF2、PTPRE和GPR65）的表达水平显著高于其他物种。IRF2作为免疫抑制因子，能够通过竞争性结合DNA结合位点来抑制抗病毒反应，而IRF9则在抗病毒免疫中扮演重要角色，尤其是在干扰素信号通路中。这些发现进一步支持了蝙蝠肺部免疫系统在控制病毒的同时，能够避免过度炎症反应的假设。

从病毒基因组的分布来看，病毒RNA主要集中在编码区，尤其是gag-pro-pol和gag-pol区域。这些区域编码了病毒颗粒的关键成分，如衣壳蛋白、膜融合蛋白和整合酶，表明蝙蝠肺部的病毒感染可能处于活跃复制状态。然而，值得注意的是，尽管蝙蝠肺部检测到了多种病毒，但与之前的一项研究（Li等人的宏基因组分析）相比，重叠的病毒种类较少。这可能是由于两种研究方法的差异所致。Li等人的研究使用了全基因组DNA测序，能够检测到低丰度或非转录的病毒序列，而本研究则依赖于基于polyA的单细胞RNA测序，主要捕捉的是活跃转录的病毒RNA。因此，某些病毒可能在蝙蝠体内处于潜伏状态，未能被本研究检测到。

此外，研究还发现R. affinis肺部的抗病毒基因模块在与其他物种的比较中表现出显著的特异性。这种特异性可能源于蝙蝠独特的进化路径和生态适应性。例如，一些蝙蝠物种（如果蝠）表现出持续的I型干扰素表达，而其他物种（如小蝙蝠）则依赖于诱导性的抗病毒反应。这种差异表明，蝙蝠的抗病毒策略可能因物种和生态习性而异，进一步强调了深入研究不同蝙蝠物种免疫系统的重要性。

尽管研究结果提供了关于蝙蝠抗病毒机制的重要线索，但仍然存在一些局限性。首先，研究数据来源于单一野生个体，这可能影响结论的普遍性。其次，Viral-Track和Cell Ranger在识别感染细胞时存在部分重叠，这可能反映了病毒RNA丰度对宿主基因组对齐效率的影响。尽管如此，这些数据仍然为蝙蝠抗病毒研究提供了宝贵的资源，尤其是在揭示病毒如何在宿主细胞中存在并维持的同时，不引发严重病理反应方面。

总体而言，这项研究揭示了R. affinis肺部在病毒感染下的独特免疫特征，包括抗病毒基因的表达、免疫细胞的激活以及细胞间通讯网络的重塑。这些发现不仅有助于理解蝙蝠作为病毒宿主的生物学机制，还可能为开发新的抗病毒策略提供理论支持。未来的研究需要进一步扩大样本范围，纳入更多蝙蝠物种，并采用更全面的病毒检测方法，以更全面地揭示蝙蝠抗病毒免疫的多样性及其在病毒与宿主共进化中的作用。