香丹注射液通过保护线粒体和抑制炎症，减轻小鼠败血症引起的心肌损伤

《Frontiers in Medicine》：Attenuation of sepsis-induced myocardial injury by Xiangdan injection via mitochondrial protection and inflammation suppression in mice

脓毒症心肌损伤模型中Xiangdan注射通过抑制炎症反应、减少心脏损伤标志物及保护线粒体结构发挥剂量依赖性心肌保护作用，效果在革兰氏阳性与阴性菌诱导的模型中均一致。

　　在临床医学和基础研究领域，败血症诱导的心肌损伤（Sepsis-induced Myocardial Injury, SIMI）一直是一个备受关注的热点问题。败血症是一种由感染引发的全身性炎症反应综合征，可能导致多个器官功能障碍，是全球范围内导致死亡的重要原因之一。据估计，每年有约4900万例败血症患者，其中近1100万例死亡。在这些患者中，SIMI尤为常见且具有较高的致死率，可能出现在高达60%的严重败血症病例中，并对早期死亡率产生显著影响。SIMI的主要表现包括心肌收缩力下降、心律失常以及心脏生物标志物如B型钠尿肽（BNP）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的升高，这些指标与不良预后密切相关。SIMI的发病机制复杂，涉及全身性炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍和心肌细胞凋亡等多个方面。

在败血症的炎症反应中，模式识别受体（Pattern Recognition Receptors, PRRs）扮演着关键角色，特别是Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4），它能够识别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的成分，如革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）和革兰氏阳性菌的肽聚糖或脂磷壁酸。TLR4的激活会引发下游的NF-κB信号通路，并导致促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的释放，这些细胞因子会损害心肌收缩力，进而导致组织损伤。与此同时，Janus激酶2/信号转导子和转录激活子3（JAK2/STAT3）通路的激活也会影响心肌的炎症反应和细胞凋亡过程，两者之间的交叉调控可能加剧心肌损伤。线粒体损伤，如嵴结构破坏、肿胀和空泡化，是SIMI的典型特征，也是败血症心脏能量衰竭的重要原因。

尽管在液体复苏、血管活性药物和抗菌治疗方面取得了进展，但目前尚无针对SIMI中炎症和线粒体相关机制的特异性治疗手段。因此，传统中药制剂作为辅助治疗的潜力逐渐受到重视。其中，Xuebijing注射液由红花、白芍、川芎、丹参和当归等药材提取制成，自2004年起在中国获批使用，并在预临床败血症模型中显示出抗炎、抗氧化、抗凋亡和保护内皮细胞的作用。多项荟萃分析和大型临床试验，如EXIT-SEP研究（样本量为1817例），已报道Xuebijing注射液作为西药辅助治疗时，可降低28天死亡率并减轻促炎标志物的升高。实验数据还表明，Xuebijing及其相关制剂能够调节TLR4/NF-κB和JAK2/STAT3信号通路，改善线粒体形态，并限制心肌细胞损伤。

基于上述背景，本研究进一步探讨了Xiangdan注射液在由革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）引发的SIMI模型中的心肌保护作用。研究采用随机分组方法，将雄性C57BL/6小鼠分为假手术组、败血症组以及不同剂量的Xiangdan注射液治疗组。Xiangdan注射液以原制剂形式通过口服灌胃给予，剂量范围为2.0、2.5和5.0 mL/kg，分别对应不同的活性成分暴露水平。研究主要关注生存率、血清促炎细胞因子水平、心肌损伤生物标志物、组织病理学变化以及线粒体超微结构完整性。通过这些指标的评估，研究旨在明确Xiangdan注射液是否能够在不同病原体引起的SIMI中提供广泛的心肌保护作用，并验证其是否符合已知的TLR4/NF-κB和JAK2/STAT3信号通路调节机制。

在实验设计中，Xiangdan注射液的剂量选择基于既往的药理学研究，这些研究评估了其在心肌缺血和心绞痛等动物模型中的心血管保护作用。同时，还参考了实验室的初步耐受性测试。具体而言，2.0 mL/kg代表在大鼠模型中最低有效剂量，能够产生血流动力学和抗炎益处；而5.0 mL/kg则接近既往发表的预临床研究中安全有效的上限。在初步剂量研究中，未观察到急性毒性或不适的迹象，这表明该剂量范围在动物实验中具有良好的安全性。此外，该剂量范围还符合经过所有ometric转换后的临床推荐人类剂量，这支持了其临床转化的潜力。

尽管Xiangdan注射液在临床实践中主要用于静脉给药，但本研究选择通过口服灌胃方式给予，主要基于以下考虑：（1）以减少小动物重复静脉穿刺带来的应激反应；（2）确保在不同时间点的剂量精确和可重复性；（3）遵循与相关中药制剂相似的预临床研究惯例。因此，本文在描述实验过程时，特别强调了“口服给予Xiangdan注射液”这一实验方法。Xiangdan注射液以原制剂形式给予，不添加额外溶剂，以确保实验条件的一致性。假手术组和败血症对照组则接受相同体积的无菌生理盐水，以控制实验操作和溶剂对结果的影响。

实验采用的动物模型为雄性C57BL/6小鼠，年龄为6-8周，体重为25-28克，所有实验方案均经过浙江中医药大学动物实验伦理委员会的批准。小鼠被饲养在受控环境中，包括温度20±5°C、湿度50-70%、12小时光照/黑暗周期，且可自由获取食物和水。实验分为九组，每组10只小鼠，包括假手术组、革兰氏阳性菌败血症组、革兰氏阳性菌败血症联合不同剂量Xiangdan注射液治疗组、革兰氏阴性菌败血症组以及革兰氏阴性菌败血症联合不同剂量Xiangdan注射液治疗组。Xiangdan注射液在实验前12小时和细菌挑战后立即给予，以评估其预防和早期干预效果。这一给药方案虽然有助于研究药物的预防作用，但并未完全模拟临床治疗条件，因为在临床实践中，治疗通常是在诊断后开始。

在实验过程中，研究人员通过监测呼吸频率、心率、活动性和一般行为来评估小鼠的状况。败血症严重程度根据既往建立的小鼠临床评分系统进行评估，包括体重下降、毛发状态、活动性、姿势和对刺激的反应。在细菌挑战后12小时，小鼠被麻醉并从腹主动脉采集1 mL血液，血液在4°C下以3000 rpm离心10分钟，分离血清后保存于-80°C。随后使用ELISA试剂盒检测血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、HMGB1、BNP、CK-MB和cTnI等细胞因子和生物标志物的水平，以评估炎症反应和心肌损伤程度。

为了进一步评估心肌组织的病理变化，研究人员将心脏组织固定在4%多聚甲醛中24小时，然后进行石蜡包埋、切片、脱蜡和苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, HE）染色。心肌损伤程度由两位独立的盲法评估者在光学显微镜下使用Kishimoto评分系统进行评分，该评分系统评估纤维排列、间质水肿、肌节模糊和炎症细胞浸润。通过这些方法，研究人员能够准确评估心肌组织的病理状态。

为了评估线粒体的超微结构完整性，研究人员使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）进行分析。心肌组织在4°C下用2%戊二醛固定5小时，随后用1%锇酸进行后固定2小时。经过脱水和包埋后，制备50-100 nm的超薄切片，并用铀酸盐和铅盐染色。每个样本随机选择5个视野进行分析，使用Flameng评分系统评估线粒体的损伤程度，包括嵴结构完整性、肿胀和空泡化。这一评分系统能够提供关于线粒体损伤的定量数据，以支持心肌保护作用的评估。

实验中使用的统计分析方法为GraphPad Prism 9.0，所有数据以均值±标准差（mean ± SD）表示。异常值被排除，如果数值超过组均值的2倍标准差。对于主要结局指标，使用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Tukey校正进行分析，以评估细菌类型（革兰氏阳性 vs. 革兰氏阴性）、剂量及其相互作用的影响。效应大小和95%置信区间的结果被报告在表格和补充材料中，以支持因子设计的分析，而不是多次单因素测试。

实验结果显示，Xiangdan注射液在不同剂量下显著改善了由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引发的SIMI模型中的生存率、炎症细胞因子水平、心肌损伤生物标志物水平、组织病理学变化和线粒体结构完整性。在12小时观察期内，Xiangdan注射液治疗组的生存率显著高于败血症对照组，且呈现剂量依赖性趋势。在所有关键指标中，Xiangdan注射液的剂量依赖性效果明显，包括促炎细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β和HMGB1）和心肌损伤生物标志物（BNP、CK-MB和cTnI）的减少。此外，Xiangdan注射液在改善线粒体结构方面也表现出显著效果，尤其是在最高剂量组中，线粒体形态接近正常。

实验中还观察到，不同细菌类型（革兰氏阳性 vs. 革兰氏阴性）引起的SIMI在Xiangdan注射液治疗后表现出相似的治疗效果，这表明其作用具有广泛的适用性。此外，Xiangdan注射液的剂量依赖性效果在所有关键指标中均得到验证，包括促炎细胞因子和心肌损伤生物标志物的减少，以及线粒体结构的改善。尽管本研究未直接测量TLR4、NF-κB、JAK2、STAT3及其磷酸化状态，但其结果与这些通路的调节机制一致，但并未直接证明。未来研究应结合Western blotting或免疫组织化学方法，进一步验证这些通路的调节作用，并明确Xiangdan注射液的具体分子靶点。

本研究的实验设计采用的是预防性加早期干预的给药方案，即在细菌挑战前12小时和挑战后立即给予Xiangdan注射液。这种设计虽然有助于研究药物的预防作用，但并未完全模拟临床治疗条件，因为在临床实践中，治疗通常是在诊断后开始。因此，未来研究应采用严格的后损伤给药方案，以更好地模拟临床干预，并评估Xiangdan注射液在败血症发生后是否仍能保持其疗效。此外，应包括不同性别和品系的小鼠，以评估性别差异对免疫和心血管反应的影响，并提高研究结果的普适性。最后，应进行更长期的研究，以评估心肌保护作用的持续性和恢复情况。

尽管本研究在实验设计中考虑了多种因素，但仍有局限性。例如，实验仅限于急性期（12小时）后的评估，而更长期的研究将有助于了解心肌保护作用的持续性和恢复情况。此外，本研究未进行正式的药代动力学和毒性评估，尽管在最高剂量下未观察到急性不良事件，但这些评估对于优化剂量和确保临床转化的安全性至关重要。因此，未来研究应结合这些评估，以进一步验证Xiangdan注射液的临床应用潜力。

综上所述，本研究为Xiangdan注射液在SIMI中的心肌保护作用提供了新的证据，并支持其作为败血症辅助治疗的潜力。研究结果表明，Xiangdan注射液能够通过调节上游的炎症和线粒体通路，显著改善心肌损伤和线粒体结构。这些发现不仅有助于理解中药干预在败血症中的作用机制，也为未来的基础和临床研究提供了重要的方向。通过进一步研究，有望将Xiangdan注射液从实验性治疗推向临床应用，并为败血症患者的综合治疗策略提供新的选择。