将CIRCLE-seq与RNA-seq结合使用，以解析AML（急性髓系白血病）中eccDNA（环状DNA）的数量、定位和功能特征

《Frontiers in Oncology》：Integrated CIRCLE-seq with RNA-seq to decipher the quantity, localization, and functional features of eccDNA in AML

本研究首次通过CIRCLE-seq和RNA-seq直接表征急性髓系白血病（AML）中环状外染色体（eccDNA）的基因组特征及功能，发现AML患者eccDNA数量及基因涉及度显著高于健康对照，且富集于特定染色体及调控区域，激活MAPK等致癌通路，并与mRNA共上调的570个基因相关，这些基因与患者不良预后显著相关。

　　近年来，随着对癌症基因组学研究的深入，科学家们发现了一类特殊的非染色体DNA结构——外源性环状DNA（extrachromosomal circular DNA, eccDNA）。这类DNA分子在多种癌症中扮演着重要角色，不仅能够通过基因扩增促进肿瘤生长，还可能影响基因表达调控、肿瘤异质性和治疗耐药性。然而，尽管eccDNA在实体瘤中的研究已取得一定进展，其在血液系统恶性肿瘤中的作用却仍处于探索阶段。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）作为一种高度异质性的血液癌症，其发病机制复杂，涉及基因突变、染色体重排、表观遗传调控等多方面因素。因此，深入研究AML中eccDNA的分布特征及其功能意义，对于理解疾病进展和开发新的治疗策略具有重要意义。

本研究首次采用CIRCLE-seq技术对AML患者的骨髓细胞进行eccDNA直接测序，并结合RNA-seq数据，系统分析了eccDNA的基因内容、功能影响以及与临床预后的关联。研究对象包括12例AML患者和4例健康对照者，通过高通量测序方法揭示了eccDNA在AML中的显著富集特征，并进一步探讨了其在基因表达调控和肿瘤发生中的作用。研究结果表明，AML细胞中eccDNA的数量和基因参与度均显著高于健康对照组，且呈现出独特的长度分布模式，主要集中在202和368 bp这两个尺寸区间。此外，eccDNA在染色体上的分布并非随机，而是呈现出对特定染色体（如1、2和10–19号染色体）的偏好性，尤其是在基因启动子区域和调控区。这种非随机分布可能与染色体结构的不稳定性和特定的DNA修复机制有关。

在功能分析方面，研究发现AML相关eccDNA显著激活了多个与肿瘤发生密切相关的信号通路，例如MAPK、ErbB信号通路以及涉及细胞生长和蛋白修饰的生物过程。这些通路的异常激活可能与AML细胞的增殖、存活及侵袭能力增强密切相关。同时，研究还发现，eccDNA携带的基因在mRNA水平上也表现出相应的上调，其中包含多个与AML相关的关键基因，如FLT3、RUNX1和CD33等，以及潜在的致癌基因。值得注意的是，这些基因的高表达与AML患者的不良预后显著相关，提示eccDNA可能不仅是疾病发展的伴随现象，更可能是影响临床结果的重要因素。

研究还通过整合分析，识别出570个在eccDNA和mRNA水平上均被上调的基因，以及66个被下调的基因。这些基因的上调可能反映了AML细胞中某些关键通路的激活，而下调的基因则可能与肿瘤抑制功能的丧失有关。例如，γδ T细胞相关基因的下调可能表明eccDNA对AML细胞免疫逃逸能力的增强具有潜在影响。γδ T细胞作为先天免疫的重要组成部分，其功能的削弱可能使AML细胞更容易逃避宿主免疫系统的识别和攻击。此外，研究还发现，eccDNA在调控染色质结构方面可能具有重要作用，例如通过影响组蛋白修饰和染色质重塑复合物的活性，从而改变基因表达的可及性。

本研究的发现不仅拓展了我们对AML中eccDNA分布和功能的理解，还揭示了其在肿瘤发生中的潜在机制。与实体瘤相比，AML中的eccDNA表现出不同的生物特征，如非随机的染色体分布和独特的长度偏好。这可能与AML特有的基因组不稳定性、染色体断裂和DNA修复机制有关。此外，研究还指出，当前对AML中eccDNA的研究多依赖于间接方法，如ATAC-seq和基因组阵列分析，而本研究通过直接测序技术提供了更精确的eccDNA图谱，有助于进一步探索其在AML中的具体作用。

尽管研究结果具有重要意义，但本研究也存在一些局限性。首先，样本量较小，可能限制了对AML不同分子亚型和临床表现的全面分析。其次，CIRCLE-seq技术本身可能存在一定的技术偏差，例如由phi29聚合酶引起的扩增偏差，以及在映射环状DNA时的挑战。这些偏差可能影响eccDNA的定量和定性分析。此外，本研究主要基于观察性分析，虽然揭示了eccDNA与不良预后之间的相关性，但尚未明确其因果关系。因此，未来的研究需要在更大规模的AML队列中验证这些发现，并进一步探索eccDNA在肿瘤发生中的具体机制。

为了更全面地理解eccDNA在AML中的作用，未来的研究可以采用多种方法，包括CRISPR等基因编辑技术，用于靶向删除或扩增特定的eccDNA片段，并观察其对细胞表型的影响。此外，研究eccDNA在疾病进展过程中的动态变化，以及其在治疗过程中的响应情况，也有助于评估其在临床治疗中的潜在价值。同时，随着长读长测序技术的发展，对eccDNA的完整结构进行分析，将有助于揭示其更复杂的调控网络，从而为AML的精准治疗提供新的思路。

综上所述，本研究通过直接测序和整合分析，首次系统描绘了AML中eccDNA的图谱，并揭示了其在基因表达调控和肿瘤发生中的重要作用。eccDNA的积累不仅与AML细胞的基因组不稳定性密切相关，还可能通过激活致癌通路和抑制免疫反应，促进疾病的进展和不良预后。这些发现为AML的分子机制研究和临床治疗提供了新的视角，同时也强调了进一步探索eccDNA功能的必要性。未来的研究应关注如何克服当前技术的局限性，推动对eccDNA在AML中的具体作用机制的深入理解，并探索其作为生物标志物和治疗靶点的潜力。