设计针对HER2的双重特异性抗体，以促进受体内化并恢复抗肿瘤疗效

《Frontiers in Immunology》：Engineering HER2-targeted biparatopic antibodies to promote receptor internalization and restore antitumor efficacy

HER2靶向双特异性抗体A9B5-Bs-5和A9B5-Bs-7通过非重叠表位结合促进受体内化，克服曲妥珠单抗耐药性，体外实验显示优于常规组合疗法。

　　HER2（人类表皮生长因子受体2）在多种实体瘤中扮演着关键的致癌驱动因子，包括乳腺癌、胃癌以及其他类型的癌症。HER2的过度表达与疾病的侵袭性增强及预后不良密切相关。尽管针对HER2的靶向治疗，如曲妥珠单抗（trastuzumab）和帕妥珠单抗（pertuzumab），在临床实践中显著改善了HER2阳性癌症患者的生存率，但治疗抵抗，尤其是对曲妥珠单抗的耐药性，仍然是当前治疗面临的主要挑战。为了应对这一问题，研究人员开发了两种新型的IgG-VHH双靶点抗体（bpAbs），即A9B5-Bs-5和A9B5-Bs-7，它们通过将高亲和力的HER2胞外结构域（ECD）I结合的纳米抗体A9B5与IgG骨架融合，实现了对HER2不同表位的特异性识别。这些bpAbs在HER2表达的肿瘤细胞中展现出更高效的受体内化能力，以及相较于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合疗法更强的抗肿瘤活性，特别是在曲妥珠单抗耐药模型中表现突出。

HER2的结构动态特性，尤其是其形成二聚体的能力，是其致癌活性及对靶向治疗产生抵抗的根源。HER2的胞外结构域（ECD）II的二聚化臂（DA）是其二聚化过程中的关键区域，而近期结构研究表明，ECD I-III界面在形成二聚体结合口袋中起着重要作用。因此，针对ECD I或III的抗体，与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗联合使用，已被证明在克服治疗抵抗方面具有协同效应。A9B5纳米抗体正是基于这一原理，被发现能够与曲妥珠单抗在耐药模型中产生显著的协同作用。这些发现表明，设计针对新型表位的双靶点抗体，能够更全面地阻断HER2驱动的信号传导路径，为下一代受体靶向生物制剂的开发提供了新思路。

抗体的结构形式对其功能、稳定性以及可开发性具有重要影响。目前已有超过50种双特异性抗体（bsAbs）的结构形式被开发出来，其中IgG-VHH融合抗体因其高溶解性、稳定性以及较低的错配风险而备受关注。IgG-VHH融合抗体通过将单域纳米抗体（VHH）与IgG骨架结合，能够在保持抗体功能的同时，减少传统bsAb结构形式可能带来的挑战。在本研究中，研究人员构建了一系列IgG-VHH双靶点抗体，其中A9B5-Bs-5和A9B5-Bs-7表现出最强的HER2结合能力与抗肿瘤效果。这两种抗体分别将A9B5纳米抗体融合到曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的轻链N端，通过特定的连接子（GGGGS）实现结构上的灵活性与功能性。

在实验评估中，研究人员采用多种方法验证了这些双靶点抗体的功能特性。通过生长抑制实验，评估了不同抗体对HER2阳性肿瘤细胞的抗增殖能力。结果表明，在无配体刺激的条件下，A9B5-Bs-5和A9B5-Bs-7在多种细胞系中表现出优于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的抑制效果，尤其是在曲妥珠单抗耐药的MCF7和JIMT-1细胞中。此外，通过荧光激活细胞分选（FACS）和共聚焦显微镜技术，研究人员进一步验证了这些抗体对HER2受体的结合能力及其内化效率。数据显示，A9B5-Bs-5和A9B5-Bs-7能够显著促进HER2受体的内化，而传统单克隆抗体如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗则效果有限。这一现象可能与双靶点抗体通过结合不同表位，增强受体聚集和内化有关。

为了进一步理解这些双靶点抗体的结合机制，研究人员利用AlphaFold 3进行了结构建模。结果表明，A9B5纳米抗体与HER2-ECD的结合模式为跨分子结合（trans-binding），即A9B5结合一个HER2分子，而曲妥珠单抗或帕妥珠单抗结合另一个HER2分子，从而促进受体聚集。这种结合方式不仅有助于阻断HER2驱动的异源二聚体形成，还可能通过增加受体的内化和降解，进一步抑制肿瘤细胞的生长。此外，结构建模还显示，A9B5的结合表位在配体激活的HER2构象中仍然可及，表明其在多种肿瘤微环境中均可能发挥功能。

本研究还探讨了双靶点抗体的开发策略及其在临床应用中的潜力。HER2靶向治疗的耐药性源于多种机制，包括HER受体的突变、受体表位的掩盖以及补偿性信号通路的激活。传统的单靶点抗体往往难以应对这些复杂的耐药机制，而双靶点抗体通过同时阻断多个信号通路，有望提高治疗效果。在当前的HER2靶向治疗中，大多数双靶点抗体都聚焦于ECD II和ECD IV，而忽视了ECD I和ECD III的潜在作用。本研究中，A9B5纳米抗体的结合表位位于ECD I，这一发现为开发新型双靶点抗体提供了新的方向。此外，通过结构建模和功能实验，研究人员验证了这些抗体在促进HER2受体聚集和内化方面的优势，为后续的临床研究奠定了基础。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，纳米抗体与HER2的结合模式是基于AlphaFold 3的预测模型，虽然该模型具有较高的准确性，但最终的结构细节仍需通过冷冻电镜或X射线晶体学等技术进行验证。其次，目前的实验主要基于体外模型，尚未在体内模型中验证这些双靶点抗体的抗肿瘤效果。此外，某些配置可能表现出激活HER2信号的特性，这可能与纳米抗体的空间排列有关，具体机制仍需进一步研究。最后，尽管A9B5纳米抗体在体外表现出优异的结合能力，其在实际临床中的应用效果仍需通过更多实验和临床试验来验证。

综上所述，本研究通过设计和评估新型的IgG-VHH双靶点抗体，为HER2靶向治疗提供了新的策略。A9B5-Bs-5和A9B5-Bs-7在HER2阳性肿瘤细胞中表现出更强的结合能力、更快的受体内化以及更显著的抗肿瘤效果，特别是在曲妥珠单抗耐药模型中。这些抗体的结构设计和功能特性表明，通过结合非重叠表位，可以更有效地阻断HER2驱动的信号传导，从而提高治疗效果。未来的研究需要进一步探索这些抗体在体内模型中的表现，并验证其是否能够通过Fc介导的效应功能（如补体依赖性细胞毒性，CDC）增强治疗效果。此外，针对HER2不同表位的双靶点抗体设计，可能为克服耐药性提供新的解决方案，推动HER2靶向治疗的进一步发展。