利用完整的线粒体基因组明确bocachico（Prochilodus magdalenae）与bocachico de Maracaibo（Prochilodus reticulatus）（属于脂鲤目：Prochilodontidae科）之间的物种界限

《Frontiers in Genetics》：Clarifying species boundaries between bocachico (Prochilodus magdalenae) and bocachico de Maracaibo (Prochilodus reticulatus) (characiformes: Prochilodontidae) using complete mitochondrial genomes

本研究通过测序并分析Prochilodus reticulatus和P. magdalenae的完整线粒体基因组，结合系统发育树和时间校准，证实两者为独立物种，分化时间约6.9百万年前，与安第斯山脉抬升事件吻合。首次完整线粒体基因组揭示两者在COI、CYTB等基因上的显著差异，并纠正了公共数据库中的序列误标问题。

　　这项研究聚焦于解决两种南美淡水鱼——*Prochilodus magdalenae* 和 *Prochilodus reticulatus* 之间的分类问题。这两种鱼同属脂鲤目（Characiformes）的拟脂鲤科（Prochilodontidae），在形态学上具有高度相似性，导致传统分类方法难以准确区分。此外，以往的研究主要依赖部分线粒体基因序列，这些数据的不完整性使得它们的系统发育关系模糊不清，甚至有研究认为它们可能是同一种鱼的不同亚种。然而，本研究通过获得三种完整的 *P. reticulatus* 线粒体基因组，并结合其他多种分子标记和系统发育分析，提供了清晰的分类证据，揭示了它们在进化树上属于不同的分支。

*Prochilodus* 属的鱼类广泛分布于南美洲的多个河流系统，包括哥伦比亚、委内瑞拉、法属圭亚那、苏里南、巴西、秘鲁、玻利维亚、阿根廷、巴拉圭和乌拉圭等地。尽管该属共有13个已知物种，但分类上的不确定性仍然存在。例如，有研究发现 *P. rubrotaeniatus* 和 *P. nigricans* 似乎由两个遗传上不同的谱系组成，而非单系演化群体。这一发现促使研究人员将该属的潜在谱系数量从13个增加到15个。同样，*P. magdalenae* 和 *P. reticulatus* 之间的分类问题也因形态学相似性和有限的分子数据而持续存在。因此，本研究的目的是通过完整的线粒体基因组序列和更全面的系统发育分析，为该属的分类和保护工作提供新的数据支持。

在分类学上，*P. magdalenae* 和 *P. reticulatus* 的区分主要依赖于地理分布和某些形态学特征的模态值。*P. magdalenae* 仅分布于哥伦比亚的马格达莱纳河、辛乌河和阿特拉托河，以及考卡河流域，海拔范围在1000米以下。而 *P. reticulatus* 的分布则涉及哥伦比亚的卡塔图莫河和委内瑞拉的马拉开波湖流域，覆盖从高海拔到低地的区域。这种地理上的分布差异可能是它们分化的重要因素之一。然而，形态学特征的重叠使得仅凭外观难以准确区分这两种鱼，因此需要借助分子数据来进一步确认它们的分类地位。

在分子层面，区分 *P. magdalenae* 和 *P. reticulatus* 也面临挑战。随机扩增多态性DNA（RAPD）分析未能有效区分这两个物种。此外，一些研究发现它们在多个线粒体基因（如COI、CYTB和16S rRNA）以及三个核基因（如Myh6、Rag1和Rag2）上的序列相似性极高，导致研究者推测它们可能属于同一个物种，经历了不同地理区域的分化（allopatric divergence）。然而，最近的研究提出了不同的观点，认为这两个物种可能在中新世中期（约1440万年前）从该属的其他成员中分化出来，并在更新世晚期（约240万年前）由于地理隔离进一步分化。然而，由于 *P. reticulatus* 的线粒体基因组序列在公共数据库中有限，这些研究的结果难以验证。

本研究的一个关键突破在于获得了 *P. reticulatus* 的三个完整线粒体基因组序列，并结合了 *P. magdalenae* 的两个完整线粒体基因组序列，进行系统发育分析。与以往仅使用部分线粒体基因相比，完整的线粒体基因组包含了所有蛋白质编码基因、rRNA基因、tRNA基因以及控制区（CR），这使得系统发育分析的分辨率更高，结果更可靠。此外，完整基因组的分析有助于检测和纠正公共数据库中的序列误标问题，因为它们可以覆盖多个基因区域，从而提供更全面的遗传信息。

通过分析多个线粒体基因（包括COI、CYTB、ATP8/ATP6、tRNA-Pro和16S rRNA），研究发现 *P. reticulatus* 和 *P. magdalenae* 在这些基因上形成了不同的单系群体（clades），并且在系统发育树上得到了极高的支持值（UFBoot = 100%）。这一结果与之前的研究形成对比，表明当使用正确的序列数据时，这些分子标记可以可靠地区分这两个物种。然而，一些之前被标记为 *P. reticulatus* 的序列，如COI和CYTB的某些片段，实际上可能来源于 *P. magdalenae* 或其他相关物种，这种误标现象可能是由于形态学特征的重叠和分类方法的不完善所导致。

此外，研究还通过贝叶斯时间校准方法，估计了 *P. magdalenae* 和 *P. reticulatus* 的分化时间约为690万年前，这一时间与安第斯山脉东部山系的最终隆起事件相吻合。这一发现支持了地理隔离在物种分化中的作用，并与其他研究结果一致，例如，其他拟脂鲤科鱼类（如 *Pseudoplatystoma* 和 *Ichthyoelephas*）也经历了类似的分化过程。这表明，安第斯山脉的地理变化可能在塑造该属鱼类的系统发育关系中发挥了重要作用。

本研究还揭示了公共数据库中存在严重的序列误标问题，这在其他生物分类学研究中也有所体现。例如，鸟类和真菌的序列数据库中也存在大量因误鉴定或数据处理错误而被错误标记的基因组序列。这种误标现象可能导致系统发育分析的不准确，从而影响对物种关系的理解。因此，研究强调了使用标本馆存档的实体标本（voucher specimens）和可追溯的元数据的重要性，以确保分子分类研究的可靠性。

在方法上，本研究采用了多种技术手段，包括Illumina和Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序平台，以确保线粒体基因组的完整性和准确性。Illumina测序提供了高质量的短读数据，而ONT的长读测序则有助于填补基因组中的缺口，提高组装的连续性和准确性。通过结合这两种测序技术，研究团队成功构建了 *P. reticulatus* 和 *P. magdalenae* 的完整线粒体基因组，并对其进行了详细的注释和分析。此外，研究还对基因组的结构特征进行了探讨，包括基因顺序、密码子使用模式和碱基组成等，这些信息有助于进一步理解该属鱼类的遗传多样性。

研究结果不仅澄清了 *P. magdalenae* 和 *P. reticulatus* 的系统发育关系，还为未来的研究提供了重要的数据支持。这些数据对于该属鱼类的分类、保护以及渔业管理策略具有重要意义。特别是在生态和经济价值较高的地区，如哥伦比亚和委内瑞拉，这些信息可以为生物多样性保护和可持续资源管理提供科学依据。此外，本研究还展示了使用便携式ONT测序设备进行完整线粒体基因组测序的可行性，这为资源有限的研究机构提供了一种新的选择。

总的来说，这项研究通过完整的线粒体基因组测序和系统发育分析，解决了长期存在的分类问题，并强调了分子数据在物种识别中的关键作用。同时，它也指出了公共数据库中存在误标问题，并呼吁在分类研究中使用标本馆存档的标本和可追溯的元数据，以提高分类的准确性。这些发现不仅对 *Prochilodus* 属的研究具有重要意义，也为其他具有形态学相似性的物种分类提供了参考价值。