多尺度3D全关节细胞与分子成像技术揭示了疾病特异性神经血管可塑性，这种可塑性是结构与疼痛关系背后的关键机制

《Advanced Science》：Multiscale 3D Whole Joint Cellular and Molecular Mapping Reveals Disease-Specific Neurovascular Plasticity Underlying the Structure-Pain Relationship

3D多尺度分析揭示关节结构-疼痛关联机制及MUSIC方法的应用

　　在现代医学研究中，了解骨骼肌关节的结构与疼痛之间的关系对于揭示关节健康与疾病调控机制以及开发新的治疗策略至关重要。骨骼肌关节作为人体内复杂的多尺度系统，其结构和功能涉及多种组织，如骨骼、连接组织和肌肉，这些组织在解剖学和分子水平上具有独特的三维特性。然而，传统方法在捕捉跨尺度的结构变化和疾病特征方面存在局限性。例如，磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）虽然能提供宏观层面的解剖信息，但对细胞和分子层面的变化缺乏敏感性。而常规的组织学方法虽然能获得高分辨率的组织和细胞信息，却无法在器官尺度上提供完整的三维空间背景。因此，单一尺度的研究往往无法全面揭示关节疾病的发生发展机制。

针对上述挑战，研究者们开发了一种名为MUSIC（Musculoskeletal Joint Immunostaining and Clearing）的新技术，旨在克服完整关节免疫染色和光学透明化过程中遇到的关键问题。MUSIC方法结合了先进的光片显微镜技术，能够实现对多种关节类型和不同物种（如小鼠、大鼠和猪）的完整关节进行三维高分辨率的细胞和分子映射。该方法不仅避免了不同关节之间的图像配准需求，还能够揭示关节内部的异质性神经血管分布以及之前未被表征的神经血管通路。研究结果表明，关节结构与疼痛之间的关系并非普遍适用，而是依赖于特定的疾病类型，这为理解不同疾病背景下的疼痛机制提供了新的视角。

通过应用两种互补的关节疾病模型——退化性关节疾病和创伤性损伤，研究团队揭示了疾病特异性的微尺度神经血管改变。在退化性关节疾病模型中，例如缺乏蛋白聚糖4（Prg4）的小鼠模型，研究发现关节结构的退化与高度血管化和神经支配的侧囊和滑膜组织密切相关，同时揭示了之前未被报道的髁突血管网络变化。而在创伤性损伤模型中，通过强制张口（FMO）模型，研究团队进一步观察了神经血管结构在时间上的动态变化，并发现了在损伤区域前部的疼痛感知神经纤维出现显著的退化和再生现象，尽管在宏观层面没有明显的形态学变化。这些结果表明，疼痛感知可能与神经末梢的敏感化或神经性疼痛机制有关。

MUSIC方法不仅适用于小鼠，还被扩展至大鼠和猪的关节组织。例如，在大鼠的膝关节和颞下颌关节（TMJ）中，研究人员成功实现了神经血管结构的三维映射，揭示了不同物种之间的神经血管分布的保守性。在猪的TMJ样本中，尽管样本尺寸较大，仍然能够清晰地观察到神经和血管的分布情况，显示出该方法在不同动物模型中的广泛适用性。此外，MUSIC技术还能够对骨骼内部的神经血管结构进行可视化，这为研究骨骼的微观变化提供了新的工具。

该方法在实验过程中经历了多步骤的优化。首先，通过使用乙二胺四乙酸（EDTA）对固定关节进行脱钙处理，确保骨骼的可渗透性。随后，采用小胶束去污剂CHAPS和糖胺聚糖（GAGs）提取技术，对关节组织进行深度渗透，提高免疫染色的效率。为减少抗体在长时间染色过程中可能发生的聚集问题，研究团队引入了七甲基β-环糊精，这种化学物质已被证明能有效降低抗体聚集。最后，选择二苯醚（DBE）作为光学透明化试剂，其与免疫染色的兼容性良好，能够有效清除复杂的器官组织，包括骨骼和肌肉。

为了验证MUSIC方法的有效性，研究团队进行了多方面的实验。例如，通过对比三维免疫染色与二维切片染色的结果，确保该方法能够准确捕捉关节组织的微观结构变化。在三维数据采集过程中，研究者利用先进的光片显微镜技术，实现了对完整关节的大范围、高通量成像。这种方法不仅提高了成像速度，还减少了光漂白效应，从而保证了数据的完整性和准确性。此外，研究团队还对不同关节部位进行了详细的三维重建和定量分析，包括神经纤维长度密度、血管体积比例等指标。

MUSIC方法的另一个重要特点是其对多种动物模型的适应性。无论是小鼠、大鼠还是猪，该方法都能有效处理不同尺寸和结构的关节样本。这种跨物种的适用性为临床研究提供了重要的支持，使得研究者能够在更接近人类的动物模型中探索关节疾病的发生机制。同时，该方法还具备良好的可扩展性，能够处理较大的组织样本，如猪的TMJ样本，其尺寸可达40毫米，为未来研究更复杂的关节结构提供了可能性。

在数据处理方面，研究团队采用了多种技术手段，包括图像分割、定量分析和三维可视化。通过使用Imaris软件，研究人员能够对不同组织进行手动分割，并生成三维模型以展示神经血管结构的空间分布。此外，为了减少肌肉组织对神经血管结构的干扰，研究者在分析过程中对肌肉信号进行了去除处理，从而提高了图像的清晰度和数据的准确性。这种方法不仅适用于小鼠关节，也适用于大鼠和猪的样本，显示出其在不同物种中的普适性。

MUSIC方法的引入为骨骼肌关节研究提供了全新的视角。它能够将宏观结构与微观神经血管变化联系起来，揭示关节疾病中结构和疼痛之间的复杂关系。通过该方法，研究者可以更全面地理解神经血管网络在关节组织中的分布和功能，以及这些结构如何在疾病过程中发生变化。这些发现不仅有助于揭示疼痛的分子机制，还为开发更精准的诊断工具和治疗策略提供了理论依据。

此外，MUSIC方法在临床前研究中的应用也具有重要意义。通过对不同动物模型的实验，研究团队能够模拟人类关节疾病，从而为未来的临床转化研究奠定基础。该方法的灵活性和高分辨率使得研究者能够在多种实验条件下探索关节组织的动态变化，例如在退化性关节疾病模型中观察到的血管和神经变化，以及在创伤性损伤模型中发现的神经末梢退化和再生现象。这些数据不仅加深了对关节病理生理机制的理解，还为疼痛机制的研究提供了新的方向。

总的来说，MUSIC方法为骨骼肌关节的多尺度三维分析提供了一个强大的平台。它不仅克服了传统方法在样本处理和成像方面的局限性，还能够捕捉到跨尺度的结构变化，从而揭示关节疾病中结构与疼痛之间的复杂关系。通过这一方法，研究者可以更深入地探索神经血管网络在关节中的作用，以及这些结构如何在不同疾病背景下发生变化。未来，随着技术的进一步发展，MUSIC方法有望在更广泛的医学研究领域中得到应用，包括在人体组织中的研究，从而为关节疾病的诊断和治疗提供新的思路和工具。