具有真空驱动腔室的多尺度微流控平台，用于自动化大批量单链DNA（ssDNA）的生成

《Lab on a Chip》：Multiscale microfluidic platform with vacuum-driven chambers for automated high-volume ssDNA generation

单链DNA自动化生成多尺度微流控平台通过真空驱动的大体积反应室和金纳米棒光热效应实现快速热循环，20个PCR循环仅需12分钟，66%单链DNA回收率，92%互补链保留率。

　　单链DNA（ssDNA）在分子生物学和生物技术领域中具有广泛的应用价值，是许多关键实验技术的基础材料。从DNA测序到基因编辑、从诊断检测到生物传感，ssDNA的应用几乎涵盖了现代生物医学的各个方面。特别是在CRISPR-Cas9系统中，ssDNA作为引导模板参与同源定向修复，使得基因编辑的精准性得以提高。此外，ssDNA还被用于单核苷酸多态性（SNP）分析、单链构象多态性（SSCP）分析、滚环扩增（RCA）和等温扩增（LAMP）等技术中，其在信号放大中的作用至关重要。在荧光原位杂交（FISH）技术中，ssDNA作为捕获探针，能够高效地定位特定的DNA或RNA序列，为疾病诊断和基因表达分析提供重要手段。而在体外适配体选择（SELEX）过程中，ssDNA更是发挥着核心作用，通过筛选过程生成具有高特异性的适配体，用于生物传感、靶向药物递送和分子诊断等应用。

为了满足这些应用对ssDNA的高需求，传统的ssDNA生成方法存在一定的局限性。最常见的方式是通过加热和冷却双链DNA（dsDNA）以破坏氢键，从而实现ssDNA的分离。然而，这种方法效率低下且难以重复，常常需要额外的步骤进行纯化，如酚/氯仿提取或聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），这些步骤不仅复杂，而且对分离效果存在一定的限制。另一种方法是利用酶如λ或T7外切酶选择性地降解dsDNA中的一条链，保留另一条链作为ssDNA。然而，这种方法依赖于5′端磷酸化效率，若未完全降解，残留的dsDNA仍可能影响后续处理的效率。

近年来，PCR技术被广泛用于ssDNA的生成，特别是在珠式PCR（bead-based PCR）中，通过将引物固定在磁珠上，可以实现对DNA模板的高效扩增。然而，传统的PCR过程通常需要数小时来完成，因为温度循环的效率较低。此外，手动操作带来的污染问题也会影响最终的产物质量。为了解决这些问题，研究人员开始探索基于微流控技术的新型PCR系统，以实现自动化、高通量和快速的ssDNA生成。

微流控技术的核心在于其对流体的精确控制，通过微通道实现对微量液体的操控。然而，传统的微流控系统在处理较大体积的液体时存在一定的挑战，主要在于热传导和对流的效率受限。为克服这一限制，研究团队提出了一种多尺度微流控平台，结合了真空驱动的反应腔体和微流控组件，如微混合器和气动驱动的微阀，以实现对较高体积反应液的高效处理。该系统能够在短时间内完成20轮PCR反应，仅需12分钟，远低于传统方法所需的时间。同时，该平台还通过真空驱动的液体处理方式，减少了硬件复杂性，提高了反应效率。

真空驱动反应腔体的设计是该系统的关键创新之一。与传统的微流控腔体相比，真空驱动腔体的体积大了一个数量级，能够容纳高达20微升的反应液。这种设计不仅提升了系统的处理能力，还有效避免了传统微流控系统在处理较大体积时的热不均匀问题。在珠式PCR过程中，金纳米棒（AuNRs）作为光热转换材料，被分散在反应液中，通过光照射实现均匀的体积加热。这种加热方式能够确保反应腔体内温度分布的均匀性，从而提高PCR反应的效率和一致性。此外，AuNRs相较于其他光热材料，具有更高的吸收-消光比、可调的长波长表面等离子共振（LSPR）以及更优的长宽比，这些特性使其在体积加热方面表现更佳。

在实验中，研究人员使用了磁珠作为PCR反应的载体，这些磁珠表面被修饰以固定反向引物，从而实现对DNA模板的高效捕获和扩增。通过真空驱动的微流控系统，磁珠能够被准确地引入反应腔体，并在PCR过程中保持稳定。在PCR完成后，通过真空驱动的废液腔体将反应液中的非目标成分清除，随后使用含有AuNRs的洗脱缓冲液进行多次清洗，以确保残留物质的去除。最后，通过光热加热将磁珠上的双链DNA（dsDNA）进行热解离，释放出单链DNA（ssDNA），并通过微流控系统将其收集到指定的收集腔体中。整个过程实现了高度的自动化，避免了手动操作带来的污染风险。

实验结果显示，该系统能够有效回收66%的ssDNA，并且保留了92%的互补链，表明在热解离过程中，dsDNA的污染显著减少。此外，ssDNA的回收效率和产量与传统方法相当甚至更高，而总处理时间仅需不到15分钟，远快于常规方法。这表明，该平台在高通量、高效率和高纯度方面具有显著优势。同时，实验还发现，AuNRs的浓度对PCR反应效率具有重要影响。在2.5 nM AuNRs的浓度下，系统能够在12分钟内完成20轮PCR反应，且温度曲线的稳定性良好，显示出良好的热控制能力。

在微流控系统中，真空驱动的反应腔体不仅提高了液体处理的效率，还解决了传统微流控系统在深腔结构中流体交换不充分的问题。相比传统的压力驱动方式，真空驱动方式能够实现更彻底的液体填充和排出，同时减少了对复杂微阀的依赖，从而简化了系统设计。此外，该系统在处理过程中表现出较低的蒸发损失，仅在20轮PCR反应中平均损失14%的液体，这得益于快速的温度循环和较小的气相空间。

该平台的多尺度架构不仅适用于ssDNA的生成，还为其他生物技术应用提供了扩展的可能性。例如，该系统可以用于蛋白质纯化、稀有细胞和外泌体的富集与纯化，以及病原体的检测。通过进一步集成上游的分离模块，该平台有望实现SELEX过程的完全自动化，从而推动体外适配体筛选技术的发展。

总的来说，该研究通过结合真空驱动的反应腔体和微流控技术，成功开发了一种高通量、高效率的ssDNA生成平台。该系统不仅克服了传统微流控技术在处理较大体积反应液时的限制，还通过AuNRs的体积加热特性实现了快速而均匀的温度控制。此外，该平台在自动化、减少污染和提高回收效率方面表现出色，为未来的高通量生物技术应用提供了新的思路和方法。随着进一步的优化和扩展，该技术有望在更广泛的生物医学领域中得到应用，推动从实验室到实际应用的转化。