负载血红蛋白的ZIF-8纳米颗粒，通过与人血清白蛋白结合实现隐形功能，成为稳定且生物相容的氧气载体

《Nanoscale Advances》：Hemoglobin-loaded ZIF-8 nanoparticles functionalized with human serum albumin as stealth, stable, and biocompatible oxygen carriers

本研究开发了一种新型血红蛋白基氧载体（HBOC），通过将血红蛋白（Hb）包载于ZIF-8纳米颗粒中，并依次修饰聚-L-赖氨酸（PLL）和人类血清白蛋白（HSA），利用戊二醛（GA）交联增强稳定性。结果表明，HSA包被显著降低免疫球蛋白G吸附，提高循环稳定性，同时保持Hb的氧结合与释放功能。细胞毒性测试显示其生物相容性优于传统PEG修饰的HBOC。该纳米颗粒为战场急救和输血医学提供了安全有效的氧运输平台。

　　血红蛋白基氧载体（HBOCs）为传统的供体红细胞（RBCs）输血提供了一种有前景的替代方案，特别是在紧急情况和战场环境中，血源有限以及储存条件严格的问题使得传统输血面临重大挑战。HBOCs通过将血红蛋白（Hb）封装在纳米颗粒中，提供了一种快速恢复组织供氧的手段，同时具备广泛的兼容性、无菌性、较长的储存稳定性和便于运输的优势。然而，HBOCs的临床应用一直受到Hb在血液中自由状态下的潜在有害影响的限制，例如免疫反应、血流动力学变化和氧化应激等。为了克服这些局限性，研究者们开发了多种策略，包括化学修饰和封装技术，以提高Hb的稳定性和生物相容性。在这些方法中，使用金属-有机框架（MOF）作为载体，如沸石咪唑酸酯框架-8（ZIF-8），因其高孔隙率和良好的生物相容性，成为HBOCs研发的热门选择。

ZIF-8纳米颗粒（NPs）能够有效封装Hb，但其生物相容性和循环时间仍需进一步优化。为了解决这一问题，研究人员提出了一种新型策略，通过在ZIF-8纳米颗粒表面共价结合人类血清白蛋白（HSA），从而增强其稳定性、生物相容性及循环时间。HSA是人体血浆中最丰富的蛋白质，具有良好的生物相容性、高溶解性、长循环半衰期以及作为“去免疫化”蛋白（dysopsonin）的功能。HSA能够与促免疫识别的蛋白（如IgG）竞争结合，从而减少Hb纳米颗粒被免疫系统识别和清除的可能性。此外，HSA还能减少非特异性蛋白吸附，提高纳米颗粒的“隐形”特性，使其更难被巨噬细胞系统（MPS）清除。因此，通过HSA对ZIF-8纳米颗粒进行表面修饰，不仅有助于延长Hb的循环时间，还能降低其免疫原性，从而提升其在临床应用中的安全性和有效性。

为了实现HSA的有效结合，研究人员采用了一种分步处理方法，首先通过聚-L-赖氨酸（PLL）桥接ZIF-8纳米颗粒，随后使用戊二醛（GA）进行交联，以稳定HSA层。PLL是一种带正电的生物聚合物，其在生理pH条件下能与ZIF-8纳米颗粒表面的负电荷相互作用，从而促进HSA的吸附。通过调整PLL和HSA的浓度以及交联时间，研究人员发现最优的纳米颗粒表面修饰条件，使得Hb的负载量和封装效率达到较高水平。最终的纳米颗粒被命名为Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs，其中“XL”表示在PLL和HSA沉积后使用GA进行交联。该优化策略显著提高了纳米颗粒的稳定性，同时减少了Hb在生理条件下的释放。

为了验证纳米颗粒的稳定性和功能特性，研究人员对不同条件下的Hb@ZIF-8 NPs进行了稳定性评估。结果显示，未涂层的Hb@ZIF-8 NPs在PBS和DMEM等生理相关介质中迅速降解，释放出大量Hb。而Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs在这些介质中表现出更高的稳定性，Hb的释放率显著降低。此外，通过Cryo-SEM（冷冻扫描电子显微镜）和ζ电位测量，研究人员发现Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs具有均匀的球形结构，尺寸约为316 nm，这在HBOCs的尺寸范围内，有助于防止纳米颗粒从血管中渗漏并避免其在微循环中引起不良反应。此外，ζ电位的变化表明，HSA涂层有效减少了纳米颗粒表面的正电荷，使其更接近人体血液的电荷状态，从而降低其被免疫系统识别的风险。

Hb的功能性评估是HBOCs研发的关键环节。研究人员通过紫外-可见分光光度法（UV-Vis）和氧解离曲线（ODC）分析了Hb在纳米颗粒中的氧结合和释放能力。结果显示，Hb@ZIF-8/PLL/HSA_XL和Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs的Hb在氧结合和释放过程中表现出与自由Hb相似的特性。尽管ZIF-8结构可能对Hb的氧结合亲和力产生影响，但纳米颗粒的氧解离曲线（ODC）显示其p50值（即Hb达到50%氧饱和的氧分压）明显低于自由Hb，表明其对氧的亲和力增强。这一现象可能与ZIF-8中含有的咪唑酸配体有关，该配体可能模拟组织中的组氨酸残基，通过配位作用稳定Hb与血红素的结合。此外，Hill系数（n_H）的下降也表明Hb的氧结合行为呈现一定的协同性，但仍低于自由Hb的协同程度。这种变化可能是由于Hb在纳米颗粒中的结构微调所导致，但其功能仍然保持良好，为HBOCs的临床应用提供了理论依据。

为了进一步验证HSA涂层对纳米颗粒的“隐形”效果，研究人员评估了其对IgG和BSA的结合能力。通过荧光标记技术，研究人员发现Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs在生理相关介质中表现出显著的抗IgG吸附特性，而BSA的结合能力则保持良好。相比之下，PEG涂层虽然在传统HBOC研究中被广泛使用，但由于抗PEG抗体的增加，其“隐形”效果可能受到挑战。HSA涂层在降低IgG结合的同时，还能维持BSA的结合，从而在免疫系统中实现“伪装”效果，延长纳米颗粒的循环时间。这一特性对于HBOCs在体内长期循环具有重要意义。

生物相容性评估进一步验证了Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs的安全性。研究人员使用RAW 264.7小鼠巨噬细胞系进行细胞活力测试，结果显示在0.5 mg/mL的浓度下，纳米颗粒对细胞的毒性效应较低，细胞活力（nCV）达到了ISO 10993-5标准中规定的最低可接受阈值（70%）。这表明Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs具有良好的生物相容性，能够在体内安全地释放氧并减少对细胞的毒性影响。相比之下，先前的ZIF-8基HBOCs在低浓度下仍表现出显著的细胞毒性，而Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs的优化表面修饰有效改善了这一问题。

研究结果表明，Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs在多个方面优于传统HBOCs。首先，其具有更高的封装效率和负载量，能够有效运输氧。其次，通过HSA的修饰，纳米颗粒在体内表现出更长的循环时间，同时减少了免疫系统的清除。第三，Hb在纳米颗粒中的功能得到了保留，氧结合和释放能力没有显著下降。这些特性使得Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs成为一种安全、有效的氧运输载体，有望在未来用于输血医学和缺氧相关治疗。

尽管研究结果令人鼓舞，但研究人员也指出，当前的结论主要基于体外实验，无法完全反映体内复杂环境下的行为。因此，未来的HBOC研究需要进一步探索其在体内的细胞摄取、细胞内处理、清除途径、生物分布、药代动力学和治疗效果。这些研究将有助于全面评估Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs在实际应用中的安全性和有效性。此外，为了确保其临床转化，还需进行长期的体内外实验，以确认其在不同生理条件下的稳定性和生物相容性。

综上所述，Hb@ZIF-8/PLL_XL/HSA_XL NPs作为一种新型HBOC平台，展现了在生理相关条件下的高稳定性、良好的生物相容性以及优异的氧运输功能。这种纳米颗粒的优化策略不仅有助于克服传统HBOCs的局限性，还为未来开发更安全、更高效的氧载体提供了坚实的基础。研究结果表明，HSA涂层在提升Hb纳米颗粒的稳定性、减少免疫识别以及延长循环时间方面具有显著优势，同时不影响Hb的氧结合和释放能力。这些特性使其成为潜在的下一代HBOC材料，有望在医疗实践中发挥重要作用。