三阴性乳腺癌髓系微环境单细胞图谱揭示VEGFAhi中性粒细胞与SPP1hi巨噬细胞共定位形成血管生成新生态位

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Single-cell transcriptomics of the myeloid milieu reveals an angiogenic niche in triple-negative breast cancer

本研究针对三阴性乳腺癌（TNBC）免疫微环境中髓系细胞高度异质性及功能不清的问题，通过整合单细胞转录组与空间转录组数据，系统解析了TNBC髓系细胞亚型、发育轨迹及空间分布特征。研究发现VEGFAhi中性粒细胞和SPP1hi巨噬细胞在缺氧区域共定位形成血管生成新生态位，并通过ADM-CALCRL等配体-受体对与APLNhi内皮尖端细胞相互作用。临床队列分析显示SPP1hi巨噬细胞富集与患者不良预后显著相关，且该亚型在小鼠TNBC模型中高度保守。该研究为TNBC血管靶向治疗提供了新靶点。

　　

三阴性乳腺癌（TNBC）作为乳腺癌中最具侵袭性的亚型，因缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2表达靶点，治疗选择有限且预后极差。近年来，肿瘤微环境（TME）尤其是髓系细胞在肿瘤进展中的作用备受关注。髓系细胞包括中性粒细胞和单核/巨噬细胞等，具有高度异质性，既可发挥抗肿瘤作用，也能通过促进血管生成、免疫抑制等机制加速肿瘤发展。然而，TNBC中髓系细胞的具体亚型、功能特性及空间分布模式仍不明确，这限制了针对髓系细胞的精准治疗策略开发。

为解决这一难题，首尔国立大学医学院的Yechan Choi、Minkyu Shim等研究人员联合多个国际团队，在《Experimental & Molecular Medicine》上发表了题为"Single-cell transcriptomics of the myeloid milieu reveals an angiogenic niche in triple-negative breast cancer"的研究论文。该研究通过整合自建与公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，构建了TNBC髓系细胞的高分辨率图谱，并结合空间转录组技术揭示了髓系细胞在TNBC中的空间组织规律及功能生态位。

研究人员首先通过批量RNA测序数据比较发现，TNBC患者肿瘤组织中髓系细胞相关通路显著富集，且髓系细胞浸润程度显著高于非TNBC亚型。这一发现提示髓系细胞在TNBC发展中可能发挥关键作用。为深入解析髓系细胞组成，研究团队收集了25例TNBC患者肿瘤样本（包括5例自建样本和20例公共数据集样本），通过荧光激活细胞分选（FACS）富集CD11b⁺髓系细胞进行scRNA-seq检测，最终获得24,217个高质量髓系细胞数据。

分析鉴定出9个中性粒细胞亚型和9个单核/巨噬细胞亚型。中性粒细胞亚型包括S100A12^hi、CXCR1^hi、CXCR2^hi IFIT3^hi等早期分化亚型，以及VEGFA^hi、CCL3^hi IFIT3^lo、CCL3^hi IFIT3^hi和CD74^hi等晚期分化亚型。轨迹分析显示，中性粒细胞在肿瘤内经历从早期向晚期的分化过程，其中VEGFA^hi中性粒细胞高表达血管生成相关基因，而CD74^hi中性粒细胞则表现出抗原提呈功能特征。

单核/巨噬细胞方面，研究识别出VCAN^hi单核细胞、SPP1^hi单核细胞等2个单核细胞亚型，以及SPP1^hi巨噬细胞、CXCL10^hi巨噬细胞、CCL3^hi巨噬细胞、IL1B^hi巨噬细胞、LYVE1^hi巨噬细胞、CD163^hi巨噬细胞和MKI67^hi巨噬细胞等7个巨噬细胞亚型。发育轨迹分析揭示了两个主要分化路径：经典炎症谱系（VCAN^hi单核细胞→IL1B^hi巨噬细胞→CXCL10^hi巨噬细胞→CCL3^hi巨噬细胞）和SPP1谱系（VCAN^hi单核细胞→SPP1^hi单核细胞→SPP1^hi巨噬细胞）。功能分析显示，SPP1^hi巨噬细胞高表达缺氧应答和代谢应激相关基因，并富集于肿瘤血管生成通路。

为解析髓系细胞的空间分布特征，研究人员对43例TNBC样本进行空间转录组分析，通过cell2location算法将scRNA-seq定义的细胞亚型映射至组织切片。结果显示，SPP1^hi巨噬细胞独特地定位于缺氧区域，与上皮癌细胞紧密共定位，而其他巨噬细胞亚型则主要分布于血管周围。细胞互作分析发现，SPP1^hi巨噬细胞与癌细胞通过MIF-CD44等配体-受体对进行强烈相互作用。

进一步分析发现，SPP1^hi巨噬细胞与表达APLN的内皮尖端细胞（CapEC1）空间共定位，形成血管生成生态位。该生态位同时富含VEGFA^hi中性粒细胞，且VEGFA表达水平显著升高。配体-受体分析显示，SPP1^hi巨噬细胞通过ADM-CALCRL/RAMP2/RAMP3信号轴与APLN^hi内皮尖端细胞相互作用，而VEGFA^hi中性粒细胞则通过VEGF信号促进血管生成。

转录因子调控网络分析表明，ATF4在SPP1^hi巨噬细胞、VEGFA^hi中性粒细胞和血管生成生态位中共同激活，可能作为缺氧应激下的核心调控因子驱动髓系细胞的促血管生成功能。体外实验验证显示，低氧培养可诱导THP-1来源的巨噬细胞样细胞高表达SPP1和ADM，HL-60来源的中性粒细胞样细胞高表达VEGFA和ADM，重现了肿瘤内的观察结果。

临床意义方面，研究团队通过BisqueRNA和BayesPrism算法对TCGA和METABRIC队列进行批量反卷积分析，验证了髓系亚型在独立队列中的存在。结果显示，SPP1^hi巨噬细胞富集与TNBC患者总生存期和无复发生存期显著缩短相关，且当患者同时富含VEGFA^hi中性粒细胞时预后更差。

最后，研究者在EO771、EMT6和4T1小鼠TNBC模型中验证了人类髓系亚型的保守性。特别是在EMT6模型中，SPP1^hi巨噬细胞等效亚型（mMφ1）同样富集于缺氧和糖酵解相关通路。治疗干预分析发现，环磷酰胺（C140）处理可显著降低SPP1^hi巨噬细胞比例，提示该亚型可能成为联合治疗的潜在靶点。

本研究的主要技术方法包括：单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术用于构建TNBC髓系细胞图谱；空间转录组学（10x Visium）结合cell2location算法解析细胞空间分布；批量RNA测序反卷积（BisqueRNA、BayesPrism）验证临床相关性；基因集富集分析（GSEA）和基因集变异分析（GSVA）评估功能通路；轨迹推断（Slingshot、Monocle 3、scTour）重建细胞发育路径；细胞互作分析（CellChat）预测配体-受体网络；转录因子调控分析（pySCENIC）识别上游调控因子；多重免疫荧光（mIF）进行蛋白水平验证；以及小鼠原位TNBC模型（EO771、EMT6、4T1）进行跨物种验证。

研究结果总结：

髓系景观分析揭示TNBC中四大主要细胞类型

通过整合scRNA-seq数据，研究成功构建了TNBC髓系细胞综合图谱，鉴定出单核/巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和浆细胞样树突状细胞四大类群，为后续亚型细分奠定基础。

肿瘤内中性粒细胞分析显示发育和功能的异质性

中性粒细胞亚型分析揭示了从早期浸润亚型向晚期功能特化亚型的发育轨迹。功能研究表明，VEGFA^hi中性粒细胞表现出强促血管生成活性，而CD74^hi中性粒细胞则具有抗原提呈功能特征。

肿瘤内单核细胞和巨噬细胞表现出高度异质性和不同起源

巨噬细胞可分为组织驻留型（LYVE1^hi、CD163^hi）和单核来源型两大类。轨迹分析明确了经典炎症谱系和SPP1代谢应激谱系两条独立分化路径，后者与缺氧应答和血管生成功能密切相关。

SPP1hi巨噬细胞定位于缺氧生态位并与周围癌细胞主动相互作用

空间转录组显示SPP1^hi巨噬细胞独特地富集于缺氧区域，与癌细胞共定位并通过MIF-CD44等信号通路密切互作，形成独特的免疫抑制微环境。

SPP1hi巨噬细胞与APLNhi尖端细胞和VEGFAhi中性粒细胞共定位形成血管生成生态位

研究发现SPP1^hi巨噬细胞和VEGFA^hi中性粒细胞在空间上共定位于APLN^hi内皮尖端细胞周围，通过ADM-CALCRL和VEGF信号协同促进肿瘤血管生成。

批量反卷积验证髓系亚型在临床数据集中的存在并实现基于预后的患者分层

临床队列分析证实SPP1^hi巨噬细胞富集与TNBC患者不良预后显著相关，且与VEGFA^hi中性粒细胞共存时预后更差，确立了其作为预后生物标志物的价值。

SPP1hi巨噬细胞在小鼠TNBC模型中保守且可被环磷酰胺靶向

跨物种比较显示SPP1^hi巨噬细胞在小鼠TNBC模型中高度保守，且环磷酰胺处理可降低该亚型比例，为临床干预提供了临床前模型基础。

结论与讨论：

本研究通过单细胞和空间转录组技术系统解析了TNBC髓系微环境，首次揭示了VEGFA^hi中性粒细胞与SPP1^hi巨噬细胞在缺氧生态位中的共定位模式及其协同促血管生成机制。研究发现ATF4作为核心转录因子可能介导了缺氧应激下髓系细胞的功能重编程。临床数据证实了SPP1^hi巨噬细胞的预后价值，且小鼠模型中的保守性为靶向该亚型的治疗策略开发提供了平台。该研究不仅深化了对TNBC免疫微环境的理解，也为改善TNBC治疗预后提供了新的潜在靶点。