特异性敲除内脂素（ETP）揭示其在肾脏缺血再灌注损伤纤维化中的关键驱动作用

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：ETP-specific-knockout mice reveal endotrophin as a key regulator of kidney fibrosis in ischemia–reperfusion injury models

本研究针对既往Col6a3基因敲除模型无法区分内脂素（ETP）与其母体胶原VI（COL6）功能局限，成功构建了首个可特异性敲除ETP而保留COL6A3表达的ETPKO小鼠模型。通过肾脏缺血再灌注损伤（IRI）模型，研究证实ETP缺失显著减轻纤维化进展、降低纤维化相关基因（如Col1a1、α-SMA）表达，并改善肾功能指标。该模型为精准解析ETP在纤维化疾病中的独立作用提供了关键工具，也为靶向ETP治疗肾纤维化提供了实验依据。

　　

在慢性肾脏疾病的病理进程中，纤维化是导致器官功能丧失的核心环节。细胞外基质（ECM）的异常沉积是纤维化的典型特征，而胶原VI（COL6）作为ECM的重要成分，其a3链（COL6A3）水解产生的内脂素（ETP）近年来被发现在多种纤维化疾病中高度表达。然而，由于ETP与COL6A3在功能和表达上的紧密关联，传统Col6a3基因敲除模型无法区分二者各自的作用——这些模型要么完全缺失COL6A3（同时丧失ETP），要么保留ETP但破坏COL6结构功能，导致表型解读存在严重混淆。因此，开发一种能特异性敲除ETP而不影响COL6A3功能的动物模型，成为揭示ETP独立作用的关键。

为解决这一难题，本研究团队利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建了一种新型的Col6a3-Etp+mCherryCAAX基因敲入小鼠品系。该模型通过在Col6a3基因位点插入lox2272位点和mCherryCAAX荧光报告基因，实现在Cre重组酶作用下特异性敲除ETP编码序列，并同步激活膜定位红色荧光蛋白表达，从而实现对ETP缺失和COL6A3表达的精准示踪。将该品系与CMV-Cre小鼠交配后，获得全身性ETP敲除（ETPKO）小鼠。验证实验显示，ETPKO小鼠中Etp mRNA被完全敲除，而Col6a3 mRNA仅轻微下调，且小鼠在基础状态下未出现明显生理异常或肌肉功能缺陷，证明该模型成功实现了ETP的特异性功能缺失。

为探究ETP在肾脏纤维化中的作用，研究人员分别构建了单侧和双侧肾脏缺血再灌注损伤（IRI）模型。在单侧IRI实验中，小鼠经历30分钟肾动脉夹闭后，分别于第7天和第12天评估纤维化进程。结果显示，IRI显著诱导野生型（WT）小鼠肾脏中ETP表达上调，而ETPKO小鼠中ETP完全缺失。组织学分析发现，WT-IRI肾脏出现严重肾小管结构破坏、囊性变和广泛纤维化，而ETPKO-IRI肾脏则表现出较好的组织结构保留和纤维化面积显著减少。

在分子机制层面，RT-qPCR和免疫印迹分析显示，IRI后第12天，ETPKO小鼠肾脏中多个纤维化相关基因（如Col1a1、α-SMA、COL6）的mRNA和蛋白水平均显著低于WT小鼠。值得注意的是，Col6a3表达在ETPKO小鼠中虽略有下降，但并未出现COL6功能缺失相关的肌肉表型，说明纤维化减轻确实是ETP缺失的直接结果，而非COL6功能障碍的间接效应。

通过免疫荧光染色进一步确认，ETP在IRI肾脏中主要与表达PDGFRβ的成纤维细胞共定位，而不与内皮细胞（CD31+）或巨噬细胞（F4/80+）重叠，提示成纤维细胞是损伤条件下ETP的主要细胞来源。

在双阶段双侧IRI模型中，研究人员进一步评估了ETP缺失对肾功能的影响。结果显示，ETPKO小鼠在损伤后第14天尿 albumin 水平有下降趋势，且左肾（首次IRI后第14天）纤维化面积显著低于WT小鼠，而右肾（二次IRI后第7天）纤维化程度无显著差异，说明ETP的保护作用在纤维化进展较晚阶段更为明显。

本研究主要关键技术方法包括：利用CRISPR-Cas9基因编辑构建Col6a3-Etp+mCherryCAAX敲入小鼠模型；通过CMV-Cre介导的重组获得全身性ETP敲除（ETPKO）小鼠；建立单侧及双侧肾脏缺血再灌注损伤（IRI）模型模拟急性肾损伤与纤维化进程；采用免疫印迹、免疫荧光、RT-qPCR、组织化学染色（H&E、picrosirius red）等技术评估纤维化指标；并利用公开单细胞核RNA测序数据及细胞共定位分析确定ETP细胞来源。

研究结果

ETP特异性敲除模型的成功构建与验证

通过精准基因编辑，研究人员获得可在Cre重组酶作用下特异性敲除ETP并激活mCherryCAAX报告基因的小鼠模型。基因型鉴定、Sanger测序及蛋白表达分析均证实ETPKO小鼠中Etp mRNA完全缺失，Col6a3表达基本保留，且基础状态下无显著病理表型。

肾脏IRI诱导ETP表达并驱动纤维化进程

在单侧IRI模型中，WT小鼠肾脏IRI后ETP表达显著上调，伴随严重纤维化；而ETPKO小鼠纤维化面积显著减少，肾小管结构破坏程度减轻，表明ETP是IRI后纤维化的关键驱动因子。

ETP缺失时间依赖性抑制纤维化基因与蛋白表达

IRI后第7天，ETPKO小鼠纤维化基因表达未见显著变化；至第12天，Col1a1、α-SMA、COL6等纤维化标志物mRNA与蛋白水平均显著降低，提示ETP在纤维化进程中具有时间依赖性调控作用。

ETP主要来源于成纤维细胞

细胞共定位分析显示，IRI肾脏中ETP与成纤维细胞标志物PDGFRβ共定位，而与内皮细胞或巨噬细胞标志物无重叠，明确成纤维细胞为损伤条件下ETP的主要产生细胞。

ETP敲除改善双侧IRI模型中的肾功能

在双阶段双侧IRI模型中，ETPKO小鼠尿 albumin 水平有下降趋势，且首次IRI肾脏纤维化程度显著低于WT小鼠，进一步证实ETP缺失对肾功能具有保护效应。

结论与讨论

本研究通过构建全球首个ETP特异性敲除小鼠模型，首次在体内水平明确ETP是独立于COL6A3的肾脏纤维化关键调控因子。在缺血再灌注损伤模型中，ETP缺失显著抑制纤维化相关基因表达、减少胶原沉积、改善肾功能指标，且这一作用与成纤维细胞活化密切相关。该模型不仅解决了长期以来无法区分ETP与COL6A3功能的科学难题，也为今后研究ETP在心血管代谢综合征、肝纤维化等多器官纤维化疾病中的作用提供了可靠工具。此外，结合可诱导性Cre系统与细胞类型特异性启动子，该模型未来可用于解析不同细胞来源ETP在疾病中的贡献，为开发靶向ETP的抗纤维化治疗策略奠定坚实基础。

本研究发表于《Experimental & Molecular Medicine》，为理解纤维化发病机制及探索新的治疗靶点提供了重要理论与实践依据。