为定性和定量淡水浮游动物宏条形码研究奠定基础

《Environmental DNA》：Laying Down the Foundations for Qualitative and Quantitative Freshwater Zooplankton Metabarcoding Surveys

定量评估水体浮游动物门特异性Metabarcoding引物及样本处理方法对群落分析的影响，发现Cladocera多样性易受样本保存和DNA提取方法影响，建议采用冷冻保存和MasterPure提取组合，并建立引物扩增效率校正因子以提升定量准确性。

　　近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，DNA metabarcoding作为一种高效、快速的生物多样性调查方法，已经被广泛应用于水生生态系统的研究中。尽管如此，对于淡水浮游动物群落的研究仍相对较少，而浮游动物在淡水生态系统中扮演着关键角色，是食物链的重要组成部分，同时也是重要的生物指示物种。因此，开发适用于淡水浮游动物群落的高质量DNA metabarcoding方法具有重要意义。

本研究旨在评估DNA metabarcoding调查的关键环节，包括引物设计、样本采集与保存、DNA提取等，以期为未来淡水浮游动物群落的定性和定量调查提供坚实的基础。研究团队开发并验证了针对不同浮游动物类群（如枝角类、桡足类和轮虫）的特异性引物和通用引物，这些引物不仅能够用于传统样本（即“bulk-DNA”），也适用于环境DNA（eDNA）样本。引物的性能在两种样本类型中均表现良好，尽管在某些情况下，eDNA样本可能略微降低metabarcoding分析的效率。此外，研究还发现样本的子样本量、保存方法、DNA提取和裂解技术对浮游动物群落的多样性调查结果存在显著影响，特别是对于枝角类物种的多样性可能存在低估的风险。

在引物设计和验证方面，研究团队使用了多个目标物种的基因组数据，并通过计算引物的扩增效率来评估其性能。研究发现，引物的扩增效率是影响定量分析结果的主要因素，无论目标类群或测序深度如何，这一因素都起着决定性作用。因此，基于引物扩增效率的通用校正因子可能是提升metabarcoding调查定量能力的关键手段。此外，研究还通过构建合成DNA片段的模拟群落，评估了不同引物对目标物种丰度的预测能力，结果表明，当引物扩增效率较低时，对稀有物种的低估效应更加明显，而对优势物种的高估效应也更为显著。

在样本采集与保存方面，研究发现子样本量对DNA回收率有显著影响，较大的子样本能够提高DNA回收效率，从而提升浮游动物群落的检测概率。此外，样本保存方法（如冷冻保存与乙醇保存）对不同浮游动物类群的影响存在差异，冷冻保存对枝角类物种的检测概率有明显提升，而乙醇保存则可能导致DNA回收率下降。DNA提取方法和裂解技术对DNA回收率也存在显著影响，研究发现，使用MasterPure DNA提取试剂盒在冷冻保存样本中表现最佳，而机械裂解方法（如陶瓷珠破碎）对DNA回收率的提升效果有限，可能在某些情况下反而降低检测效率。

本研究还揭示了引物选择对浮游动物群落调查结果的潜在影响。引物的特异性与灵敏度是评估其性能的重要指标，研究发现，部分引物在特定样本类型（如eDNA样本）中表现出较低的特异性与灵敏度，这可能影响对浮游动物多样性的准确评估。因此，未来需要进一步优化引物设计，以减少这些偏差，提高定量分析的准确性。

此外，研究还强调了生物信息学参数在metabarcoding分析中的重要性。尽管本研究未详细探讨这些参数的影响，但已有研究表明，公共数据库中缺乏足够的参考序列是限制metabarcoding性能的一个重要因素。因此，未来的研究应致力于填补这些参考序列的空白，以提升对浮游动物的分类准确性。同时，增加子样本的重复次数或在子样本前进行样本均质化处理，有助于减少样本间的变异，提高检测结果的稳定性。

总体而言，本研究为淡水浮游动物群落的DNA metabarcoding调查提供了重要的理论支持和实践指导。通过优化引物设计、样本保存和DNA提取方法，可以显著提升调查的准确性和可靠性。此外，研究结果也表明，尽管eDNA样本在某些情况下可能不如传统样本，但其在生物多样性调查中的应用潜力仍然值得进一步探索。未来的研究可以结合不同样本类型，进一步验证这些方法的适用性，并在更广泛的环境背景下进行推广。最终，这些方法的应用将有助于更全面地评估淡水生态系统的健康状况，并为识别人类活动对生态系统的干扰提供科学依据。