水文变异性和连通性影响着洪泛区微生物群落的动态变化

《Limnology and Oceanography》：Hydrological variability and connectivity shape floodplain microbial community dynamics

本研究在克罗地亚多瑙河洪泛区五个相连水体中，利用16S和18S rRNA测序分析原核生物和真核微生物群落结构。结果表明，洪水强度显著影响微生物多样性、群落组成及空间连通性：中等洪水增加核心微生物数量和跨生态系统连通性，促进群落混合；低水期则限制交换，导致更孤立的群落。环境因子如水温、溶解氧和营养盐驱动群落变化，其中洪水重塑了原核和真核微生物的互作网络。该研究揭示了水文条件对洪泛区微生物群落动态的关键调控作用。

　　### 洪水对多瑙河泛滥平原微生物群落的影响

多瑙河泛滥平原是水生与陆地生态系统之间的动态接口，其生态系统功能受到微生物群落的显著影响。为了探讨自由生活和颗粒相关微生物及微生物真核生物群落的组成，研究人员在多瑙河最完好的泛滥平原之一——克罗地亚的Kopa?ki Rit地区，选取了五个相互连接的研究地点进行采样，并利用16S和18S rRNA基因扩增子测序技术进行分析。研究对比了低水位期和轻微至中度洪水期间的群落动态，发现洪水会增加微生物多样性，并根据洪水强度促进群落的逐步转变，而低水位条件则限制了微生物交换，减少了泛滥平原生态系统中的组成连通性。特别地，微生物真核生物（如Perkinsea和Fungi）的扩散效应尤为显著，这突显了水文连通性在塑造泛滥平原微生物真核生物群落结构中的重要性。洪水还促进了群落的混合以及物种间更平衡的相互作用，而低水位期则导致网络结构更加分隔。核心微生物群落的大小随着洪水强度增加而扩大，这反映了生态系统混合、异源输入以及营养物质可利用性对泛滥平原群落形成的影响。这项研究揭示了洪水强度对原核生物和微生物真核生物群落的双重影响，深化了我们对水文变化如何塑造泛滥平原微生物动态的理解。

### 洪水与水文条件对泛滥平原生态系统的影响

泛滥平原是动态且复杂的景观，它们整合了水生和陆地生态系统，并提供了关键的形态、生态和水文功能，这些功能增强了栖息地多样性，支持了生物多样性，并调节了沉积物动态（Junk et al., 1989；Preiner et al., 2018）。泛滥平原还为人类提供了重要的生态系统服务，包括洪水峰值的降低、水质的改善、碳封存、地下水补给、渔业等，这些都增强了河流系统的韧性和经济价值（Opperman et al., 2013）。它们拥有丰富的生物多样性，这种多样性与高空间和时间异质性密切相关（Junk et al., 1989）。然而，理解影响泛滥平原微生物分布的机制具有挑战性，因为局部环境条件和栖息地连通性受到水文条件的强烈影响，并且持续变化（Chaparro et al., 2018）。通常，泛滥平原会周期性地被主河流的侧向溢流所淹没，从而导致水、沉积物、营养物质、有机质和水生生物的交换（Ward and Stanford, 1995）。洪水将不同的水文特征的生境连接起来，这减少了空间变异性并导致生境的同质化（Thomaz et al., 2007）。然而，在低水位期间，泛滥平原的生境与其他生境和主河流相隔离，发展出独特的环境特征和物种组合（Junk and Wantzen, 2004）。

自由生活（FL）和颗粒相关（PA）微生物是水生微生物群落的重要组成部分，它们在泛滥平原生态系统的功能中起着关键作用。作为主要的初级生产者，蓝藻和微藻在生物地球化学转化中起着至关重要的作用，它们通过固碳、作为微生物循环中的生物量储存库支持异养微生物，并促进营养物质的吸收和转移（Lobus and Kulikovskiy, 2023）。它们的组成和动态受到多种非生物因素的影响，如温度、pH值、光照、营养物质和氧气的可利用性（Law, 2011；Mihaljevi? et al., 2013）。温带泛滥平原中的水文变化对于微生物多样性至关重要，因为它们影响了营养物质的分布和生态位的可用性（Mihaljevi? et al., 2015）。洪水已被报道对浮游植物动态产生季节性影响：它可以在早春促进生态系统过程，但在早夏由于营养物质稀释而干扰浮游植物的繁殖（Mihaljevi? et al., 2009）。泛滥平原动态河流-泛滥系统中的有机质主要来源包括浮游植物生物量、河岸生物量、沉积物生物量、土壤有机碳、落叶和腐殖质（Sutfin et al., 2016）。洪水脉冲影响了有机质的可用性和质量，从而调控细菌异养代谢（Vidal et al., 2015），而低水位期则限制了与流入的连通性，减少了有机质的周转，这可能会抑制微生物活动并降低其丰度（Boot et al., 2013）。这种相互作用促进了季节性微生物群落的发展，并导致泛滥平原微生物群落的潜在复杂性和动态变化。基于显微镜的研究表明，多瑙河的洪水通过增加浮游细菌的丰度和生物量来塑造微生物食物网，而细菌细胞大小主要受生物相互作用（如捕食）而非水文波动的影响（Luef et al., 2007；Palijan, 2012）。然而，高通量扩增子测序技术通过检测形态上无法区分的分类群、捕捉稀有生物群和提供更高的分类分辨率与功能解释，为研究提供了互补的视角。这种方法使我们能够探讨那些显微镜研究无法触及的微生物对季节性洪水的响应。

### 研究方法

本研究评估了水文条件如何影响自由生活和颗粒相关原核生物和微生物真核生物群落的组成稳定性与连通性。研究人员在多瑙河-fed的相互连接湖泊和通道网络中进行监测和高通量测序，以理解洪水强度和低水位阶段在塑造微生物群落中的作用。他们假设洪水会增强微生物交换和多样性，而低水位条件则会限制扩散并降低泛滥平原生态系统中的组成连通性。通过识别关键环境驱动因素并确定核心微生物群落作为对水文变化的响应，这项研究进一步加深了我们对温带泛滥平原微生物群落及其对水文变化的适应和韧性的理解。

### 研究方法：采样地点与采样程序

Kopa?ki Rit（图1）是多瑙河中游的一个泛滥平原，其水流量主要受多瑙河影响，其次受德拉瓦河的影响（Bonacci et al., 2002）。泛滥平原的淹没面积超过18平方公里，包括各种永久性和季节性水体，如通道和湖泊。洪水通常在春季和初夏（2月至5月）发生，当多瑙河水位超过3米时（Mihaljevi? et al., 1999）。在本研究中，水文条件被定义为多瑙河水位：低水位期（<3米）、轻微洪水（3.0–3.5米）、中度洪水（3.5–4.0米）、重度洪水（4.0–5.0米）以及极端洪水（>5米）。轻微洪水淹没约18%的泛滥平原，而极端洪水（>5米）几乎淹没整个区域（Schwarz, 2005）。

在2021年2月至9月期间，研究人员每月对五个相互连接的水体进行采样，以研究洪水变化对泛滥平原微生物群落的影响。第一个采样点是多瑙河（1，位于1388公里处），它通过Hulovo通道（2）向泛滥平原输送溢流水，最终流入永久性湖泊Kopa?ko（3）。Hulovo通道也与?onakut通道（4）相连，后者将溢流水进一步输送至泛滥平原，并流入富营养或超富营养的Sakada?湖（5）（Mihaljevi? et al., 2015）。每日多瑙河水位数据（图1b）来自1401.4公里处的水位站。研究期间未记录极端洪水事件。

在每个采样点，使用多用电表（HQ4300，Hach，美国）测量水温（WT）、pH值、溶解氧浓度（DO）和电导率（Cond）。水深（WD）通过手持测深仪（Uwitec GmbH，奥地利）确定，而水透明度则使用塞奇盘（SD）进行测量。收集1升表层水用于分析营养物质和叶绿素浓度，以及总悬浮固体（TSS）。另外，从通道和多瑙河中采集了2升无菌聚碳酸酯（PC）瓶装水，采集深度为20厘米，而湖泊的综合样品则包括整个水柱（Uwitec GmbH，奥地利）。使用无菌过滤设备，通过真空泵（Rocker 811，Rocker Scientific Co., Ltd.，台湾）依次过滤收集的水样，直到达到10微米和0.2微米的PC滤膜饱和。滤膜在-80°C下保存，直到进一步分析。

### 水分析与分析程序

确定了铵（NH4-N；HRN ISO 7150-1:1998）、亚硝酸盐（NO2-N；HRN EN 26777:1998）、硝酸盐（NO3-N；HRN ISO 7890-3:1998）、总氮（TN；HRN ISO 5663:2001 + [NO2-N + NO3-N]）和总磷（TP；HRN EN ISO 6878:2008）的浓度。总悬浮固体及其无机物（灰分重量，AW）和有机物（灰分干重，AFDW）的含量按照APHA（1992）的方法进行测定。

叶绿素浓度通过将0.5–1升水样过滤通过Whatman GF/F玻璃微纤维滤膜，将滤膜与90%乙酸乙酯混合，并在4°C下孵育24小时提取色素来测定。色素浓度随后通过分光光度法（S-200，BOECO德国）进行测定，遵循SCOR-UNESCO（1966）和Strickland和Parsons（1972）的协议。

### DNA提取、扩增与测序

使用DNeasy Power Water试剂盒（Qiagen，德国）从滤膜中提取基因组DNA，遵循制造商的协议。通过PCR扩增16S rRNA基因的高变V4区域，使用引物对515F（Parada et al., 2015）和806R（Apprill et al., 2015），这些引物特异性地针对细菌和古菌分类群。对于微生物真核生物数据集，使用引物TAReuk454FWD1和TAReukREV3（Stoeck et al., 2010）扩增18S rRNA基因的V4区域。PCR条件、DNA定量和凝胶电泳按照Selak等（2022）的协议进行。得到的扩增子被条形码标记、混合、构建文库并以双端格式（2×300 bp）在MiSeq平台上（V3化学，600个循环，Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行测序，由维也纳医科大学和维也纳大学的联合微生物组设施（JMF ID-2201-10）完成。原始序列数据通过Pjevac等（2021）的方法进行提取、修剪和质量过滤。通过DADA2 R包（版本1.20.0）实施的标准协议推断扩增子序列变异（ASVs）。分类通过SILVA数据库（Ref NR 99 release 138.1）和Protist Ribosomal Reference（PR2）数据库（v.4.12.0）进行，使用SINA版本1.6.1分类器（Pruesse et al., 2012）。核苷酸测序数据已存入NCBI数据库，生物项目访问号为PRJNA1238263。

### 统计分析

数据过滤、统计分析和可视化在R（v.4.3.2）中进行，使用phyloseq 1.46.0（McMurdie和Holmes, 2013）、vegan 2.6-4（Oksanen等, 2022）、microbiome 1.24.0（Lahti和Shetty, 2017）以及ampvis2 2.8.7（Andersen等, 2018）和ggplot2 2.8.7（Wickham, 2016）包。

共测序了160个泛滥平原样本，其中80个来自原核生物数据集，80个来自微生物真核生物数据集。每个数据集包含40个自由生活样本和40个颗粒相关样本。在四个最终子集中，每个子集有5个样本对应中度洪水，13个样本对应轻微洪水，22个样本对应低水位条件。样本中读数低于1000的被移除，最终用于下游分析的样本为158个。在统计分析之前，单例和双例ASVs被移除，除了在α多样性分析中。未在门（原核生物）或超群（ME）级别分类的扩增子序列变异被排除在进一步分析之外。原核生物数据集进一步过滤以排除线粒体和叶绿体ASVs，而微生物真核生物数据集则排除了动物界。过滤后的数据集包含2468个（FL ME）、2577个（PA ME）、3565个（FL原核生物）和3644个（PA原核生物）ASVs。

“核心”微生物组基于两个元数据因素：生态系统（通道、湖泊、河流）和水文条件（低水位、轻微洪水、中度洪水、重度洪水、极端洪水）进行定义。一个“组”指的是这两个因素的一个组合（例如，通道-低水位、湖泊-中度洪水）。为了考虑不同文库大小的差异，一个ASV被定义为存在，如果其相对丰度≥0.1%或其读数≥5。在每个组中，核心分类群是那些在至少两个样本中出现的，并且其出现频率≥0.6。为了防止在小组中高估核心分类群，对小组样本数≥5的，应用了下置信区间95%的Wilson置信度下限≥0.6的过滤。对于样本数<5的小组，该过滤被跳过。由于组样本数量不同，应用了等样本量的Bootstrap方法。在每个分析中，每个组的样本数量设置为最小可用数量（≥2样本），进行200次无放回迭代（种子=1）。所有规则均按重复应用。

核心大小被定义为每个组在Bootstrap重复中的平均核心ASVs数量，以及95%置信区间（CI）。核心覆盖度测量了每个组内核心分类群的主导程度。对于每个重复，覆盖度是每个样本中分配给组核心分类群的读数比例，然后通过样本中位数总结，再报告这些中位数的Bootstrap平均值及其95% CI。对于每个水文条件，比较生态系统特异性核心，使用Jaccard相似度，并在Bootstrap下取平均。任何生态系统中样本数<2的比较被排除（报告为NA）。每个组的核心分类群通过其平均相对丰度（跨生态系统平均）进行识别，并在最低分类水平进行可视化。

### 结果：水文动态与水化学特征

在研究期间，多瑙河泛滥平原经历了短期洪水，分别发生在2月、5月和6月，随后是7月至9月的持续洪水，最后在秋季水位下降至低于3米，导致泛滥平原与多瑙河隔离。这些水文变化显著塑造了水体化学特征，并在泛滥平原内部产生了空间差异（支持信息表S1；图2）。

在早春，泛滥平原的水体表现出高溶解氧（DO）水平（Sakada?湖为11.08 mg/L，Kopa?ko湖为19.18 mg/L），这与最低水温（皮尔逊相关系数r=-0.67，p<0.05；图2）相吻合。夏季以高水温（?onakut通道>30°C）和降低的DO为特征，Sakada?湖和Hulovo通道出现了缺氧现象。在夏季，铵（NH4-N）水平在Sakada?湖上升（平均≈0.6 mg/L，比其他地点高出五倍；图2）。硝酸盐在2月达到峰值，并在夏季局部再次上升，而亚硝酸盐在轻微洪水期间表现出空间一致性，但在夏季洪水期间则出现异质性波动。总磷（TP）值在所有地点均低于1 mg/L。叶绿素a（Chl-a）随温度季节性增加（皮尔逊相关系数r=0.35，p<0.05），在6月至7月达到峰值，尤其是在Kopa?ko湖（130.8 μg/L），这与高生物量（AFDW值，2.9–8.8 mg/L；皮尔逊相关系数r=0.77，p<0.05）一致。

### 结果：微生物α多样性模式

在所有地点，原核生物的α多样性高于微生物真核生物（图3）。原核生物的颗粒相关群落的α多样性高于自由生活群落（ANOVA，p<0.001）。多样性在多瑙河最高，随后从通道到湖泊逐渐下降，Hulovo通道与湖泊之间存在显著差异（Tukey HSD测试，p<0.05）。多样性在春季最低，但在洪水期间上升。相比之下，微生物真核生物的多样性没有表现出基于自由生活和颗粒相关的差异（p>0.05），但总体上在洪水期间高于低水位期，除了6月洪水期间，多样性出现下降（图3）。

### 结果：核心微生物分类群与群落组成

洪水扩大了大多数微生物组的核心大小和覆盖度，但颗粒相关原核生物组中这种效应较弱（图4a,b；支持信息图S1a,b、S2a,b、S3a,b）。在低水位期间，自由生活原核生物核心群落富集了SAR11 Clade III（通道）、Candidatus Planktophila（湖泊）和Sporichthyaceae hgcI clade（河流）。在洪水期间，Limnohabitans和Sporichthyaceae（hgcI）主导了河流核心群落，Luteolibacter和Sporichthyaceae（hgcI）主导了湖泊核心群落，而Polynucleobacter difficilis与Luteolibacter共同主导了通道核心群落（图4c）。颗粒相关原核生物核心在低水位和轻微洪水期间含有较少的丰富ASVs，而在中度洪水期间表现出更多的丰富性。此时，Armatimonas特有于河流核心，而Luteolibacter主导了通道和湖泊核心（支持信息图S1c）。在两种分类群中，中度洪水期间栖息地之间的核心相似度最高（图4d；支持信息图S1d）。

在两种微生物真核生物分类群中，通道和河流群落在低水位和轻微洪水期间由Cryptomonas和Rhyzophidiales主导，而在中度洪水期间，Stephanodiscus、Peniculida和Chrysophyceae成为主导分类群（支持信息图S2c、S3c）。湖泊中的颗粒相关真核生物从Cyclotella（轻微洪水）转移到Stephanodiscus和Tintinnidium（中度洪水）（支持信息图S3c）。核心分类群在中度洪水期间表现出更高的丰富度，而它们的相似度在轻微洪水期间最低（支持信息图S2d、S3d）。这表明，洪水强度决定了微生物群落是趋同还是分化，使水文成为泛滥平原中群落演替和核心群落动态的中心驱动因素。

### 结果：不同水文条件下的群落组成变化

微生物群落的组成强烈受到季节性和水文波动的影响，这些波动改变了温度、洪水强度、栖息地连通性和营养物质的可利用性。在冬季低水位期间，自由生活群落主要由Flavobacterium（支持信息图S5）主导，这是一种与复杂有机质降解相关的属（Fernandez-Gomez等, 2013），可能受益于低微生物周转率的停滞条件。在湖泊中，自由生活原核生物核心群落在低水位期间被Candidatus Planktophila富集，而在洪水期间，Luteolibacter主导了湖泊和通道的核心群落，以及颗粒相关原核生物的核心群落。这些浮游分类群与植物源有机质降解有关，是湿地生态系统中的典型特征（Zhang等, 2014；Rakitin等, 2024）。多瑙河与泛滥平原之间的水文连接也增加了河流中溶解有机质的含量（Besemer等, 2005），这促进了有机质降解过程中的细菌繁殖，如本研究所示。夏季洪水和较高的温度有利于多瑙河中的Alphaproteobacterial Clade III，并触发了蓝藻Cyanobium PCC-6307的广泛繁殖，这可能是由于营养丰富的阳光条件（Kramer等, 2024）。该属的成员通常为自由生活单细胞（Huber等, 2017），由于其小尺寸，以往的经典形态学分析未能在本研究的泛滥平原区域中识别出该属。

稀有真核生物（如Bicoecea、Pseudodendromonadales、Siluania和chytrid真菌）在洪水期间增加，反映了水文连通性和增强的有机质可利用性对异养和兼性原生生物的影响（Amoros和Bornette, 2002；Gleason等, 2008）。Bicoecea和Pseudodendromonadales是已知的细菌食性鞭毛虫（Boenigk和Arndt, 2002），它们在洪水期间繁殖，可能由于营养物质流入导致的细菌生产增加。相比之下，颗粒相关真核生物群落对洪水的响应较弱，这可能是因为颗粒附着的缓冲作用。Perkinsea和真菌表现出与扩散相关的梯度，它们的丰度在多瑙河中达到峰值，而在远离河流的区域逐渐减少。

### 结果：不同条件下的物种相互作用与群落稳定性变化

自由生活和颗粒相关原核生物群落的稳定性反映了它们对水文变化的适应性和韧性。自由生活分类群在洪水期间稳定性较低，这可能由于增加的湍流和扩散效应，而颗粒相关分类群则表现出更高的韧性（Besemer等, 2005；Yan等, 2024），这可能是因为它们的高密度和颗粒对环境波动的保护作用。

自由生活真核生物的稳定性在交替的轻微洪水和低水位期间下降，但在中度洪水期间恢复，这表明群落重组取决于洪水动态的性质和强度。相比之下，颗粒相关真核生物群落表现出整体更高的组成稳定性，尽管洪水引起的地点特定响应引入了变化。多瑙河群落保持了一致的高稳定性，这可能是因为与泛滥平原相比，它没有经历干旱-洪水周期（Besemer等, 2005）。

物种相互作用也随着水文变化而改变。在低水位期间，蓝藻是自由生活分类群中的关键分类群，形成了与Chloroflexi、Firmicutes和Nanoarchaeota紧密相连的网络。洪水促进了跨门的平衡相互作用，并通过促进微生物扩散使物种关联更加均匀。颗粒相关原核生物遵循类似模式，低水位期间以蓝藻-变形菌相互作用为主，而在洪水期间则被更均匀的网络所取代。在真核生物中，洪水增强了由扩散驱动的Ochrophyta、甲藻和隐藻之间的连通性，而低水位期则创造了分隔的网络，其中真菌在生态系统稳定期间扩展了其在物种间相互作用中的作用。需要注意的是，共现并不意味着直接的生态相互作用（Blanchet等, 2020），但这些网络为评估微生物群落在不同水文条件下相互作用的重组提供了有用的代理，补充了多样性和组成分析。

### 洪水强度和持续时间对多瑙河泛滥平原微生物群落动态的影响

洪水强度和持续时间在多瑙河泛滥平原的微生物群落动态中起着核心作用。洪水作为同质化因素，通过增强跨系统连通性、扩大微生物核心群落并重构网络以实现更平衡的跨分类群相互作用，对群落产生了深远影响。相比之下，低水位条件导致了特定分类群和相互作用的筛选，其中蓝藻和真菌占据主导地位，这可能归因于竞争筛选和更停滞的环境条件。颗粒相关群落相较于自由生活群落对短期水文波动影响较小。研究结果表明，水文脉冲的幅度影响了泛滥平原环境中的微生物多样性、稳定性以及跨系统连通性。