semen微囊化技术对冷藏三天后的Canindé山羊精子质量的影响

《Reproduction in Domestic Animals》：Efficacy of Semen Microencapsulation Technique on the Quality of Spermatozoa From Canindé Goats Kept Under Refrigeration for Three Days

微胶囊封装技术可提高山羊精子在冷 storage 中的存活率和运动性能，尤其在24-48小时内效果显著。研究采用藻酸盐微胶囊制备方法，对比传统 straw 法，发现微胶囊组在精子直线速度（VSL）、平均路径速度（VAP）及活力等参数上更具优势。实验通过计算机辅助精子分析（CASA）和 viability 测试验证了微胶囊的有效性，但72小时后两组差异缩小。该技术为延长精子体外存活时间提供了新方案，但需进一步动物实验验证实际受精效果。

　　本研究探讨了利用海藻酸微胶囊技术对山羊精液进行封装，并评估该方法在冷储存条件下是否能够提高山羊精液的保存时间，相较于传统玻璃管方法。这项研究的背景在于，巴西东北部拥有约1300万头山羊，占全国山羊总数的91%。其中，山羊群体包括高产奶山羊品种，如萨能羊和阿尔卑斯山羊，以及适应当地环境的本土品种。在这些品种中，Canindé山羊在小规模养殖中具有重要地位。然而，由于非计划性地与其他外来品种杂交，导致基因退化，使Canindé山羊面临灭绝的风险。为了保护这些品种，研究人员开始探索各种生殖生物技术，如人工授精（AI）和超数排卵与胚胎移植（MOET）。近年来，这些技术在山羊中的应用变得更加成熟和实用，使得AI成为一种可行的选择。AI的优势在于能够减少性传播疾病的风险，并通过精液冷冻保存来维持繁殖潜力。然而，人工授精过程中，大量精子被注入母羊的生殖系统，只有少数精子能够到达受精部位，这限制了该技术的效率。因此，研究发现，保持足够的精子数量在排卵期间可以显著提高受精成功率。

在进行人工授精时，如果精液是在采集后超过24小时才使用，推荐采用冷藏精液。然而，这种冷藏方法的一个问题是，长时间储存会降低精子的活性，从而影响人工授精的成功率，特别是精子的保存时间。为了克服这一问题，精子微胶囊化技术被提出作为一种有前景的解决方案。这种技术通过将精子细胞包裹在一种半渗透性的聚合物膜中，实现对精子的缓慢释放，从而延长其在母羊生殖系统中的可用时间。微胶囊的材料可以是单一的，也可以是多种材料的组合，例如海藻酸、硫酸纤维素和脂质体。海藻酸微胶囊化技术因其结构特性，能够促进营养物质和代谢产物的交换，从而有助于维持精子的活性。此外，微胶囊可以保护精子免受外界污染物的影响，包括其他精子或遗传物质。同时，它们还能抵御环境压力，如温度变化、机械冲击和有害物质的积累。

海藻酸是从褐藻中提取的非分支多糖，由葡萄糖醛酸（G）和甘露糖醛酸（M）酸残基组成。这些残基可以形成同聚物或异聚物。在凝胶化过程中，二价离子如Ca2?或Ba2?与G块相互作用，形成三维结构。海藻酸凝胶的机械性能和宏观结构取决于G/M比例和所使用的离子类型。值得注意的是，结合高比例G块的钡离子能够产生更坚固的凝胶。因此，本研究旨在验证海藻酸微胶囊化技术在山羊精液中的应用，并探讨该方法是否能够提高冷储存期间的精子保存时间，相较于传统的玻璃管方法。

为了实现这一目标，研究团队在巴西塞阿拉州的州立大学设施中进行了实验，地点位于福塔莱萨市（3°43′58″ S, 38°31′37″ W）。研究使用了性成熟状态的Canindé公羊作为精液捐献者，这些公羊的年龄在2至4岁之间，体重在35至45公斤之间。这些山羊健康状况良好，被单独饲养在畜舍中，并提供至少18%粗蛋白的浓缩饲料。矿物质和淡水可以自由获取。精液通过人工阴道法每周采集两次，并使用计算机辅助精液分析（CASA）设备进行初步评估。该设备专为山羊设计，并符合工业标准。选择精液中超过70%的前向运动精子用于后续实验。精液随后被稀释至每毫升1亿个精子，并使用2毫升的Eppendorf管分别封装在玻璃管或微胶囊中。两组样品被冷藏在4°C至5°C的环境中，并在稀释后24小时、48小时和72小时进行评估。评估内容包括精子的活性、异常性、膜完整性和DNA完整性。

在微胶囊制备过程中，研究团队采用了Hernández Pichardo等人（2021）描述的协议，并进行了适当调整。简要来说，稀释后的精液与1%的海藻酸钠溶液（在灭菌蒸馏水中制备）按1:1的比例混合。然后，使用1毫升的注射器和26G针头，将混合液从15厘米的高度滴入含有50 mM氯化钡溶液的容器中。微胶囊在该溶液中停留30秒以完成聚合过程。随后，微胶囊被用盐水溶液（0.9% NaCl）清洗两次。之后，将20个微胶囊放入含有500微升Optidux稀释剂的2毫升Eppendorf管中。为了进行结构验证，这些微胶囊在光片显微镜下进行观察，按照制造商的说明进行操作。

在精液解冻和评估过程中，玻璃管精液在37°C下解冻30秒。对于微胶囊，则将装有微胶囊和稀释剂的2毫升Eppendorf管在37.5°C下放置30分钟。随后，通过轻柔的移液操作使微胶囊结构解体。精液在解冻后24小时、48小时和72小时进行评估。评估过程包括使用CASA设备分析精子运动参数，以及通过染色和显微镜观察评估精子活性、异常性、膜完整性和DNA完整性。数据分析采用重复测量方差分析（repeated-measures ANOVA），在p < 0.05的显著性水平下进行比较。

研究结果显示，在精液收集后立即评估时，精子表现出较高的平均值（±SEM），包括体积、质量运动、精子浓度和前向运动率。在冷藏过程中，所有测试组的精子参数均随时间下降，但微胶囊组在24小时和48小时的评估中表现出更高的直行性（STR）、尾部摆动频率（BCF）和摆动（WOB）参数。此外，微胶囊组的精子活性在24小时和48小时时也显著高于玻璃管组。然而，在72小时时，这些参数的差异不再显著。这表明，海藻酸微胶囊在短期内能够更好地维持精子的运动能力和活性，但随着时间推移，其优势逐渐减弱。

研究还发现，微胶囊组的精子异常率、膜完整性和DNA完整性在冷藏过程中变化不大，与玻璃管组相比没有显著差异。这表明，微胶囊不仅能够保护精子免受外界环境的影响，还能维持其基本结构和功能。然而，精子的活性是影响人工授精成功率的关键因素之一。在冷藏期间，微胶囊组的精子活性在24小时和48小时时显著高于玻璃管组，但在72小时时两者表现相近。这一结果可能与微胶囊的结构特性有关，即它们能够减少活性精子的损失，并在储存过程中保持较高的活力水平。

此外，研究还发现，微胶囊组的精子运动参数（如VCL、VSL和VAP）在冷藏后仍保持较高水平，表明其在储存期间的运动能力没有明显下降。而BCF参数则显示出微胶囊组在24小时和48小时时的尾部摆动频率较高，这可能意味着精子在微胶囊中保持了更稳定和有效的运动模式。这些参数的变化可能与微胶囊的缓慢释放特性有关，从而延长了精子在母羊生殖系统中的可用时间，提高了受精的机会。

在讨论部分，研究团队指出，微胶囊化技术在不同物种中已被广泛应用，包括牛、猪、水牛和马。这些研究表明，微胶囊能够有效维持精子的活性、运动能力和DNA完整性。在本研究中，使用1%的海藻酸钠溶液是为了确保微胶囊的球形和均匀性，因为低于1%的浓度可能导致非球形的微胶囊，这可能影响其功能和稳定性。研究还提到，海藻酸微胶囊的结构特性使其能够促进营养物质和代谢产物的交换，从而有助于维持精子的活性。同时，微胶囊能够减少活性精子的损失，特别是在储存过程中。

研究团队还讨论了微胶囊在人工授精中的潜在应用。微胶囊的缓慢释放特性使其能够同步精子的释放与排卵，从而扩大受精窗口。例如，在猪的实验中，微胶囊化精液在冷藏24小时后仍然保持较高的活性和运动能力，这表明该技术能够有效延长精子的可用时间。类似地，在人类和水牛的实验中，微胶囊化精液在冷藏后也能保持较高的活性和运动能力。这些结果表明，微胶囊化技术在提高精子保存时间和维持其质量方面具有显著优势。

尽管本研究证明了海藻酸微胶囊化技术在山羊精液保存中的可行性，但研究团队也指出，需要进一步的体内和体外受孕实验来验证这些发现的实际应用价值。此外，研究团队还提到，微胶囊化精液的保存时间可能受到多种因素的影响，包括储存条件、微胶囊的结构和成分等。因此，未来的研究应进一步探索这些因素如何影响微胶囊化精液的保存效果，并寻找优化微胶囊化技术的方法。

研究的最后部分提到了作者的贡献和致谢。作者F.K.P.S.负责采样和数据分析，而M.S.C.、C.H.M.R.和I.M.L.A.提供了监督。S.K.、L.M.M.和V.J.F.F.则参与了文本和统计结果的批判性评估，以及手稿的撰写和文献来源的审查。所有作者都参与了最终手稿的审查和批准。此外，研究的出版费用由巴西的高等教育发展协调委员会（CAPES）资助，表明该研究得到了相关机构的支持。

总体而言，这项研究为山羊精液的保存提供了一种新的方法，即海藻酸微胶囊化技术。尽管该技术在短期内能够提高精子的保存时间和活性，但其在长期储存中的效果可能受到其他因素的影响。因此，未来的研究需要进一步探索该技术在实际应用中的效果，并评估其对山羊繁殖性能的影响。此外，研究还强调了微胶囊化技术在维持精子质量、减少氧化应激和提高受精成功率方面的潜力，为山羊的繁殖保护提供了新的思路和方法。