纤维束作为纤维填充材料，在生物打印中实现细胞各向异性

《Advanced Healthcare Materials》：Fibrillar Bundles as Fibrous Filler Materials for Attaining Cell Anisotropy in Bioprinting

细胞极化对异质组织的功能至关重要，但工程化3D组织构造中保持各向异性微环境仍具挑战。本研究提出一种新型纤维束材料（MEF技术制备），通过挤出打印过程中纤维束的剪切力实现原位定向排列，无需额外处理步骤。实验证明，该纤维束具有类ECM的微结构，能显著提升肌细胞（C2C12）的定向排列及多核肌管的成熟度，在GelMA生物墨水中表现出良好的生物相容性，为肌肉组织工程提供 scalable解决方案。

　　细胞排列对于各向异性组织（如骨骼肌、肌腱、心脏或神经组织）的功能至关重要，因为细胞极化决定了机械完整性以及信号传导的效率。然而，构建具有各向异性微环境的3D组织结构仍然是一个挑战，特别是在较大尺寸的组织工程构建中。通常，这些结构通过基于挤出的生物打印技术制造，即将含有细胞的水凝胶（也称为生物墨水）进行打印。本研究提出了一种新型的生物打印可填充材料——纤维束，这种材料能够在生物打印过程中利用剪切力实现原位对齐，而无需额外的处理步骤。纤维束由多个亚微米级纤维融合而成，能够支持强效的细胞粘附，并有效促进多种细胞类型的极化和排列。

在多种组织中，细胞排列是维持功能和结构完整性的重要因素。例如，骨骼肌组织的细胞外基质（ECM）在轴向方向上形成纤维束结构，这不仅引导了细胞的生长方向，还促进了肌肉形成和单向力的产生。同样，在平滑肌和心肌中，肌纤维的排列方向与力的生成方向一致，有助于电冲动的传导和同步收缩，以及机械稳定性以确保力的有效传递。在肌腱中，胶原纤维的各向异性和肌腱细胞的平行排列是健康组织的关键特征，而在肌腱病中这些特征会被破坏。神经组织的再生也需要细胞排列来引导轴突的生长方向，以确保功能性信号传导和组织整合。

在组织工程中，重现这种各向异性对于模拟自然结构和引导定向细胞生长至关重要。为了提供排列线索，已开发了多种方法，包括表面微/纳米拓扑结构，如微沟槽、脊柱、纤维、微图案或柱状结构。其中，纤维支架因其在引导细胞排列方面的潜力而备受关注，且已有多种技术可以生成具有不同方向、几何形状和孔隙率的纤维。湿纺纤维束、静电纺网、触摸纺纤维垫以及熔融电写（MEW）网格等技术已被用于创建2.5D和3D支架。MEW技术允许对纤维进行高精度的沉积，并生成具有复杂图案和可控拓扑的纤维，然而其整体生产效率较低，产生的纤维直径也比静电纺和触摸纺技术更小。为了克服这一限制，一种MEW的新衍生技术结合了MEW的沉积精度和通过流动导向的聚合物相分离生成连续、细直径纤维的能力，称为熔融电纤维化（MEF）。

为了制造功能性组织模型，如个性化疾病模型、药物测试或组织替代，需要构建具有分层结构和特定细胞与组织信号的3D结构。基于挤出的生物打印技术因其能够将细胞嵌入水凝胶中，成为一种广受关注的方法。这种方法不仅能够实现细胞的空间精确放置，还能结合不同细胞类型，以模拟天然组织的结构和功能。此外，生物墨水还可以通过加入其他填料进行功能化，从而提供控制药物释放、机械增强、增强生物相互作用、各向异性和细胞方向性等特性。

尽管已有多种策略用于在打印过程中或之后将纤维结构引入水凝胶，但这些策略仍然存在一些局限性。例如，通过选择性交联某些区域可以形成纤维图案，如“光丝”（FLight）方法，或者通过挤出过程中的对齐引导纤维的排列。此外，还可以将预先形成的纤维作为填料加入水凝胶中。这种纤维不仅能增强细胞排列，还能提高打印精度和机械性能。然而，传统的纤维破碎技术通常存在产量低或纤维长度不一致的问题。为此，我们开发了一种低温切割工艺，可以生产出长度和形态可控的短纤维，并通过水溶性粘附基质进行稳定收集和处理。

尽管在某些情况下，短纤维能够促进细胞排列，但使用合成聚合物如聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）和聚（ε-己内酯）（PCL）制成的短纤维往往具有较低的细胞粘附能力。因此，为了作为细胞载体，通常需要额外的处理步骤，例如等离子体处理或蛋白质的固定。如果这些短纤维具有良好的细胞粘附性，且生物墨水能够允许足够的细胞运动，它们可以用于诱导纤维内细胞的排列，这是创建高各向异性和细胞方向性的生物功能性组织模型的关键特征。

在本研究中，我们通过MEF技术制造了纤维束，采用PCL作为疏水、水不溶性结构聚合物，以及水溶性多孔生成材料（如聚乙烯醇醋酸酯，PVAc），以诱导相分离并生成纤维微结构。这些纤维束被设计为在挤出过程中通过拉伸流动对齐，并在打印的纤维中引导细胞组织。由于其形态特征与胶原纤维的拓扑结构相似，这些MEF衍生的纤维束在无需额外处理的情况下，就具有良好的细胞吸引力，从而可以直接作为生物墨水中的粘附载体。

为了评估这些纤维束对细胞排列的影响，我们研究了它们如何影响嵌入水凝胶中的不同细胞类型。作为模型系统，我们使用了C2C12骨骼肌细胞，并分析了它们在生长阶段和肌生成过程中的与纤维结构的相互作用。实验结果表明，这些纤维束能够有效引导细胞排列，特别是在与纤维轴对齐的情况下，细胞显示出高度的排列性，而对照组（平铺的培养皿）则表现出随机的细胞排列。

此外，通过2D细胞培养实验，我们发现这些纤维束能够促进多种细胞类型（如人成纤维细胞、小鼠肌母细胞、人牙周膜成纤维细胞和人骨髓来源的间质干细胞）的粘附和排列。纤维束的高表面积、适当的纤维直径和间距，以及开放的孔隙率，使得它们能够提供足够的生物物理线索，促进细胞的抓取和稳定附着。这一特性使得纤维束在无需额外的ECM涂层或功能化的情况下，就能引导细胞的生长和排列。

在3D生物打印方面，我们利用基于挤出的生物打印技术，将含有纤维束的复合生物墨水打印出来，并研究了细胞在打印后的行为。我们发现，当生物墨水中含有纤维束时，细胞能够在打印后迁移并附着到纤维束上，并在其中排列。通过荧光显微镜和共聚焦显微镜的观察，我们证实了这些纤维束在引导细胞排列方面的能力，尤其是在肌母细胞的肌生成过程中，能够促进形成具有多个细胞核的肌管，并且肌管的宽度与之前的研究结果相符。

为了确保生物墨水的可打印性，纤维束的长度和密度必须受到控制，以防止挤出过程中缠绕和堵塞喷嘴。传统的纤维破碎技术往往存在产量低或纤维长度不一致的问题。我们通过低温切割技术，生产出具有精确长度和形态的短纤维束，这使得它们能够在生物打印过程中保持结构完整性，并且在水凝胶中均匀分布。为了进一步优化生物墨水的性能，我们测试了不同浓度的生物墨水（如Pluronic和GelMA）对纤维束排列的影响。结果显示，随着生物墨水浓度的增加，纤维束的排列率也随之提高，但在一定范围内，浓度的变化对排列率的影响并不显著。

在3D生物打印中，纤维束的排列不仅受到生物墨水粘度和流变行为的影响，还受到打印参数如喷嘴直径、沉积速度和压力的影响。我们发现，当使用较高粘度的生物墨水时，纤维束在喷嘴中的排列更加均匀，且能够保持较好的打印质量。此外，纤维束的排列还受到打印后细胞行为的影响，包括细胞的增殖和迁移。通过长时间的细胞培养，我们观察到细胞能够在纤维束上生长并形成具有特定方向的肌管，这表明纤维束能够作为有效的细胞排列引导结构。

为了进一步验证纤维束在3D生物打印中的作用，我们还进行了细胞活力测试。通过使用活/死染色方法，我们发现纤维束的存在并未显著影响细胞的存活率，这表明纤维束不仅能够引导细胞排列，还能维持细胞的活性。此外，我们还研究了纤维束对细胞增殖和迁移的影响，发现纤维束能够促进细胞在打印后的迁移和附着，从而形成具有高度排列性的组织结构。

总的来说，纤维束作为一种新型的生物打印可填充材料，能够在挤出过程中利用剪切力实现原位对齐，从而有效引导细胞的排列和组织的形成。这种技术为构建具有各向异性的组织模型提供了新的可能性，尤其在骨骼肌组织工程方面展现出广阔的应用前景。未来的研究可以进一步优化纤维束的浓度、粘度以及打印参数，以提高其在生物墨水中的分散性和排列效果，同时确保细胞的存活和功能。此外，结合其他外部刺激（如电场或磁场）可能会进一步增强细胞排列和组织的功能性。