HER3通过miR-34b-5p依赖的机制上调PHF8的表达，从而促进三阴性乳腺癌的进展

《Cell Death & Disease》：HER3 promotes triple-negative breast cancer progression by upregulating PHF8 via miR-34b-5p-dependent mechanism

本研究揭示了三阴性乳腺癌（TNBC）中HER3通过抑制miR-34b-5p上调PHF8的分子机制，证实PHF8通过调控p27Kip1促进细胞周期G1-S转换，并发现该信号轴与患者生存率显著相关，为开发靶向HER3-PHF8的疗法提供了新依据。

　　三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer, TNBC）是一种具有高度侵袭性和异质性的恶性肿瘤，其特点是缺乏雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR），同时缺乏HER2基因的扩增或过表达。TNBC约占所有乳腺癌的10%至15%，由于其高度转移性以及有限的靶向治疗选择，患者的临床预后较差。目前，化疗和放疗仍然是TNBC的主要治疗手段，但治疗耐药性常常导致高复发率和较差的总体生存率。尽管免疫检查点抑制剂如帕博利珠单抗和阿特朱单抗在某些具有高PD-L1表达或高肿瘤突变负荷的TNBC患者中展现出一定的疗效，但其治疗效果仍受到肿瘤异质性、复杂的免疫微环境和耐药性发展的限制。此外，PARP抑制剂如奥拉帕利和他拉唑帕利在BRCA突变的TNBC中表现出良好的疗效，通过抑制DNA修复机制。然而，其应用仅限于携带特定基因突变的患者，并且通过BRCA的二次突变可能导致耐药性的产生。因此，目前TNBC的治疗手段仍然不足，尤其是在缺乏BRCA突变或高PD-L1表达的患者中。这些数据强调了阐明TNBC进展的分子机制、识别新的治疗靶点以及开发有效治疗策略的迫切需求。

HER3是表皮生长因子受体（EGFR）家族的成员，在多种癌症中，包括乳腺癌，与较差的临床预后和对靶向治疗的耐药性密切相关。尽管HER3在其他乳腺癌亚型中的作用已有广泛研究，但其在TNBC中的生物学功能仍不够明确。近年来，我们实验室和其他研究团队发现HER3启动的信号通路是TNBC进展的关键驱动因素。然而，HER3促进TNBC肿瘤生长的具体机制仍未完全阐明。了解这些机制对于开发针对HER3驱动型TNBC的新治疗策略至关重要。

本研究旨在明确HER3驱动TNBC进展的分子基础，特别是HER3信号通路对表观遗传修饰酶PHF8（PHD finger protein 8，也称为KDM7B或ZNF422）的调控作用。PHF8是一种重要的组蛋白赖氨酸去甲基化酶，参与表观遗传调控，通过改变染色质结构来调控基因转录。分析TCGA数据和TNBC组织样本表明HER3和PHF8的表达之间存在显著的正相关关系。我们进一步探讨了HER3信号通路如何通过miRNA依赖的机制上调PHF8表达，从而促进TNBC细胞增殖和肿瘤生长。研究发现了一条此前未被识别的HER3/miR-34b-5p/PHF8信号轴，该信号轴在TNBC进展中发挥关键作用。具体来说，HER3的激活会抑制肿瘤抑制性miRNA miR-34b-5p的表达，导致PHF8的上调，而PHF8又会通过抑制CDK抑制剂p27^Kip1的表达，促进G1至S期的细胞周期进程。功能性研究利用shRNA介导的敲低和过表达系统表明PHF8是HER3信号通路的关键下游效应因子。PHF8的缺失导致与HER3敲低相似的表型，包括G1期细胞周期阻滞和对克隆形成与增殖的抑制，而PHF8的过表达则能够部分恢复HER3缺失所导致的抑制作用。此外，通过原位肿瘤异种移植模型发现，强制表达PHF8可以恢复HER3沉默所抑制的肿瘤生长。临床数据显示，HER3和PHF8在TNBC组织样本中的表达水平呈正相关关系，而TCGA数据集的分析表明HER3/miR-34b-5p/PHF8信号轴与乳腺癌患者的不良预后显著相关。因此，我们的研究揭示了一条新的表观遗传调控通路，通过该通路HER3驱动TNBC进展，并为未来旨在阻断HER3与表观遗传相互作用的治疗策略奠定了基础。

在方法部分，我们使用了多种实验技术来研究HER3信号通路对TNBC细胞增殖和肿瘤生长的影响。首先，我们通过shRNA技术敲低HER3表达，并在HCC1806细胞中进行RNA测序（RNA-Seq）分析。结果表明，HER3的敲低显著上调了1384个基因，同时下调了1860个基因。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析揭示了多个关键的生物学过程，包括细胞周期进程和染色质重塑，这些过程在HER3敲低后发生了显著变化。此外，我们还通过KEGG通路分析进一步验证了这些变化。为了评估HER3对细胞周期的影响，我们使用了流式细胞术对敲低HER3的细胞进行分析，并发现HER3的缺失显著诱导了G1期的细胞周期阻滞。通过Western blot分析，我们检测了HER3、p-HER3、Akt、p-Akt、p27^Kip1、p21^waf1和Cyclin D1等蛋白的表达情况，发现HER3的缺失导致了p27^Kip1的上调和Cyclin D1的下调，这进一步支持了HER3在细胞周期调控中的关键作用。

接下来，我们研究了PHF8在HER3驱动的细胞周期进程中的作用。通过shRNA敲低PHF8，我们发现其显著抑制了TNBC细胞的增殖能力，表现为克隆形成能力的显著下降。同时，PHF8的缺失显著增加了细胞在G1期的积累，表明PHF8在细胞周期进程中的重要性。通过Western blot分析，我们发现PHF8的缺失导致了Cyclin D1和E2F1的表达水平下降，而p27^Kip1的表达水平上升。RT-qPCR进一步验证了这些变化，表明PHF8的缺失显著减少了其mRNA表达，同时显著增加了p27^Kip1的mRNA表达。这些结果表明，PHF8可能通过调控p27^Kip1的表达来促进TNBC细胞周期进程。

为了验证PHF8在HER3驱动的细胞周期进程中的关键作用，我们进一步研究了PHF8的过表达是否能够部分逆转HER3敲低所导致的细胞周期阻滞。结果显示，PHF8的过表达在一定程度上恢复了HER3敲低引起的G1期阻滞，并能够部分恢复HER3敲低对克隆形成能力的抑制作用。通过流式细胞术分析，我们发现PHF8的过表达显著促进了细胞周期的进展，同时减少了HER3敲低对p27^Kip1表达的抑制作用。这些结果进一步支持了PHF8在HER3驱动的细胞周期进程中的关键作用。

为了进一步探讨HER3信号通路如何通过调控miR-34b-5p来影响PHF8的表达，我们使用了TargetScan分析工具，筛选出可能调控PHF8表达的miRNA，包括Let-7a-5p、miR-34b-5p和miR-22-3p，这些miRNA都具有预测的PHF8 mRNA 3’UTR结合位点。通过RT-qPCR分析，我们发现HER3的敲低显著增加了miR-34b-5p、miR-22-3p和Let-7a-5p的表达，而miR-29作为阴性对照miRNA，其表达未发生明显变化。此外，HER3的过表达或HRG-β1的刺激显著降低了miR-34b-5p和Let-7a-5p的表达。通过构建含有PHF8 3’UTR的荧光素酶报告载体，我们进一步验证了miR-34b-5p对PHF8的调控作用。结果表明，miR-34b-5p模拟物显著降低了荧光素酶活性，而miR-34b-5p抑制剂则显著提高了PHF8的表达。这些结果支持HER3信号通路通过抑制miR-34b-5p来上调PHF8表达。

为了进一步评估HER3/miR-34b-5p/PHF8信号轴的临床相关性，我们分析了TCGA数据集中的miR-34b-5p与PHF8或HER3的表达相关性。结果显示，在多种癌症类型中，miR-34b-5p与PHF8之间存在显著的负相关关系，表明PHF8可能是miR-34b-5p的潜在靶标。然而，在总体乳腺癌队列中，这种相关性并不显著。我们计划在未来的实验中进一步分析TNBC组织样本中miR-34b-5p的表达谱，并评估其与PHF8的关联性。此外，分析miR-34b-5p和HER3在多种癌症类型中的表达关系，我们发现它们在某些癌症中呈显著的负相关，而在另一些癌症中则呈较弱的正相关，这表明存在癌症特异性的调控模式。在乳腺癌中，我们观察到miR-34b-5p与HER3表达之间存在非常弱的正相关（R = 0.062，p = 0.04），这支持了HER3/miR-34b-5p/PHF8信号轴在乳腺癌患者生存预后中的重要性。

在讨论部分，我们进一步探讨了HER3作为治疗靶点的潜力。HER3在多种癌症中与多个致癌信号通路的激活有关，包括PI3K/Akt通路。尽管HER3在TNBC中的表达低于HER2阳性或腔性乳腺癌，但越来越多的证据表明HER3在TNBC发生中仍然具有功能相关性，尤其是在其配体HRG-β1存在的情况下。我们的分析显示，HRG-β1在TNBC中的表达显著高于其他乳腺癌亚型，这与最近的研究结果一致，表明HRG-β1在TNBC中的重要性。这些结果支持HER3信号通路在促进TNBC进展中的关键作用。此外，我们之前的研究表明，通过我们开发的新型单克隆抗体4A7靶向HER3可以显著增强化疗在TNBC中的疗效，这提示HER3抑制可能在该侵袭性乳腺癌亚型中具有治疗潜力。同时，抗体-药物偶联物（ADCs）在HER3靶向治疗中的进展进一步支持了HER3作为潜在治疗靶点的重要性。一些HER3靶向的ADCs，如patritumab deruxtecan（HER3-DXd），在多种人类恶性肿瘤中展现出良好的预临床和临床活性。这些ADCs利用HER3在肿瘤细胞中的特异性表达，将细胞毒性药物直接递送至癌细胞，从而减少全身毒性。因此，进一步研究针对HER3的新型治疗策略，无论是作为单一疗法还是与其他治疗方式的联合疗法，都对TNBC的治疗具有重要意义。

除了直接靶向HER3之外，阻断其关键下游信号通路或效应因子也是一种潜在的互补策略。在本研究中，我们识别了PHF8作为HER3信号通路在TNBC中的新效应因子。有趣的是，一项早期研究显示PHF8与HER2信号通路在HER2阳性乳腺癌的发生中存在协同作用，这提示靶向PHF8可能在HER2阳性乳腺癌中具有治疗意义，以克服治疗耐药性。鉴于HER3在HER2阳性乳腺癌进展和治疗耐药性中的重要角色，我们推测PHF8可能也作为HER3信号通路的关键下游效应因子。确实，我们在TNBC模型中观察到HER3的敲低显著降低了PHF8的表达，而HER3的过表达则显著上调了PHF8的表达。PHF8作为一种关键的组蛋白赖氨酸去甲基化酶，参与多种致癌过程，包括细胞周期调控、转录激活和染色质重塑。它包含一个PHD指结构域，用于识别组蛋白或其他蛋白质上的甲基化赖氨酸残基。此外，PHF8还包含一个JmjC结构域，已知具有去甲基化活性。这些结构特征使得PHF8能够与组蛋白和其他染色质相关因子相互作用，从而调控基因转录。PHF8被广泛认为是一种转录激活因子，其主要靶向抑制性组蛋白标记，如H3K9me1/me2和H4K20me1。通过去除这些表观遗传修饰，PHF8促进开放的染色质状态，使得转录因子和RNA聚合酶II能够接近启动子区域，驱动基因表达。然而，我们当前的研究表明，PHF8可能在某些情况下也参与转录抑制，从而促进癌症进展。我们的研究结果得到了一项近期报告的支持，该报告表明PHF8与转录因子YY1相互作用，作为共抑制因子抑制一部分线粒体编码的电子传递链（ETC）基因。这种抑制进一步导致线粒体活性氧（mROS）的产生，从而促进癌症发展。我们发现，PHF8在TNBC中作为转录抑制因子，抑制了p27^Kip1的表达，从而促进细胞周期进程和细胞增殖。这种双重功能突显了PHF8作为表观遗传调节因子的复杂性。目前，PHF8与致癌转录因子之间的相互作用仍然是一个活跃的研究领域。由于c-Myc在TNBC中高度表达，并且在调控p27^Kip1表达中起重要作用，我们推测PHF8可能与c-Myc协同作用，抑制p27^Kip1的表达。我们正在进一步研究PHF8是否直接与c-Myc或其他转录调控因子相互作用，以调控p27^Kip1的表达。我们还正在探索PHF8在人类癌症中更广泛的影响。除了其组蛋白去甲基化活性外，PHF8还被报道靶向非组蛋白蛋白，包括转录因子和染色质重塑因子。PHF8与DNA拓扑异构酶2结合蛋白1（TopBP1）相互作用，从而抑制DNA损伤修复的启动。PHF8与TopBP1的分离可能为针对TopBP1的新型癌症治疗策略提供潜在途径。因此，阐明PHF8在组蛋白依赖和非依赖下的作用机制可能揭示新的治疗靶点和策略，以阻断PHF8介导的致癌信号通路。

在结论部分，我们的研究揭示了一条新的HER3/miR-34b-5p/PHF8信号轴，该信号轴驱动TNBC的进展。我们证明HER3的高表达或其信号激活会抑制miR-34b-5p的表达，从而上调PHF8在TNBC细胞中的表达。PHF8的上调通过抑制p27^Kip1的表达，促进了HER3驱动的TNBC细胞增殖和细胞周期进程。此外，我们的研究还发现HER3和PHF8在TNBC组织样本中存在显著的正相关关系，并且HER3/miR-34b-5p/PHF8信号轴与乳腺癌患者的生存预后密切相关。综合来看，我们的研究不仅加深了对HER3驱动型TNBC进展的分子机制的理解，还支持了通过阻断HER3的抗体或ADC、抑制PHF8以及利用miRNA替代疗法作为治疗HER3驱动型TNBC的潜在策略。这些发现为未来TNBC的精准治疗提供了新的思路和方向。