靶向Fyn激酶抑制黑色素瘤生长并逆转维莫非尼耐药性的协同策略研究

《Cell Death & Disease》：Fyn inhibition by TAE684: A synergistic strategy to suppress melanoma and reverse vemurafenib resistance

本研究针对BRAF抑制剂(BRAFi)耐药这一黑色素瘤治疗难题，发现非受体酪氨酸激酶Fyn在耐药机制中的关键作用。通过虚拟筛选鉴定出TAE684作为新型Fyn抑制剂，证实其可通过诱导ROS积累、DNA损伤和G2/M期阻滞促进黑色素瘤细胞凋亡，并显著逆转维莫非尼耐药性。该研究为克服靶向治疗耐药提供了新策略，具有重要临床转化价值。

　　

在皮肤癌的凶险谱系中，黑色素瘤以其侵袭性和高死亡率位居首位。过去二十年间，其发病率和死亡率持续攀升，尽管早期患者可通过手术获得良好预后，但一旦发生转移，生存率便急剧下降。当前，转移性黑色素瘤的临床治疗主要依赖免疫疗法和靶向治疗。虽然免疫疗法在晚期患者中展现出卓越疗效，但响应率低、高昂费用及严重副作用限制了其广泛应用。相比之下，靶向治疗虽初始响应率高，但耐药性问题往往在数月内出现，导致疾病复发。

BRAF基因突变是黑色素瘤中最常见的遗传变异之一，约40.3%的患者携带该突变。其中BRAF V600E突变可使BRAF活性增强约700倍，持续激活MAPK通路，促进肿瘤发生。针对这一靶点的BRAF抑制剂(BRAFi)，如维莫非尼(vemurafenib)和达拉非尼(dabrafenib)，已成为BRAF V600E突变患者的重要治疗选择。然而，肿瘤细胞通过MAPK通路的异常再活化等机制产生耐药性，成为临床实践中的主要挑战。

非受体酪氨酸激酶Fyn在调控肿瘤细胞生存、增殖和耐药性中发挥重要作用。研究表明，Fyn在黑色素瘤中高表达，与不良预后相关。在乳腺癌、慢性粒细胞白血病、前列腺癌和非小细胞肺癌中，Fyn均被证实参与耐药性的形成。然而，Fyn在黑色素瘤BRAFi耐药中的具体作用机制尚不清楚。

在这项发表于《Cell Death and Disease》的研究中，研究人员通过虚拟筛选发现TAE684作为一种有效的Fyn抑制剂，能够显著抑制黑色素瘤细胞增殖，并在体外和体内实验中证明其可通过诱导ROS(活性氧)积累、DNA损伤和G2/M期细胞周期阻滞促进细胞凋亡。更重要的是，TAE684能够逆转维莫非尼耐药性，且与维莫非尼联用表现出协同效应。

研究采用的主要技术方法包括：虚拟筛选和分子对接鉴定Fyn抑制剂；体外激酶实验和下拉实验验证TAE684与Fyn的结合；细胞活力检测(CCK-8)、集落形成、伤口愈合和Transwell实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力；RNA测序(RNA-seq)和基因集富集分析(GSEA)探索信号通路变化；彗星实验和免疫荧光检测DNA损伤；流式细胞术分析细胞周期和凋亡；以及黑色素瘤异种移植小鼠模型评估体内疗效。所有细胞系均来自ATCC，并通过STR分析认证。

TAE684有效靶向并抑制黑色素瘤细胞中Fyn的激酶活性

通过基于结构的虚拟筛选，研究人员从36个化合物中鉴定出TAE684作为最具潜力的Fyn抑制剂。分子对接分析显示，TAE684与Fyn活性位点结合，形成疏水相互作用和氢键。下拉实验在HEK293T和黑色素瘤细胞中证实了TAE684与Fyn的直接结合。体外激酶实验显示TAE684抑制Fyn的IC₅₀为130.7 nM，并能浓度依赖性地抑制Fyn对底物CD147的磷酸化。TAE684以剂量依赖方式抑制黑色素瘤细胞系(SK-MEL-28、A375和SK-MEL-5)的增殖，IC₅₀值分别为0.8095μM、0.6257μM和0.4890μM。值得注意的是，ALK选择性抑制剂劳拉替尼(lorlatinib)对黑色素瘤细胞增殖无显著影响，表明TAE684的作用不依赖于ALK。

TAE684抑制黑色素瘤细胞的恶性表型

研究表明TAE684显著抑制黑色素瘤细胞的克隆形成能力。伤口愈合实验和Transwell实验显示，TAE684以浓度依赖方式抑制细胞迁移和侵袭。在SK-MEL-28皮下移植瘤模型中，TAE684处理显著抑制肿瘤生长，且未观察到明显毒性。免疫组化分析显示TAE684治疗组Ki67阳性率降低，表明细胞增殖受到抑制。

TAE684通过引起ROS积累、DNA损伤和G2/M期细胞周期阻滞诱导凋亡

流式细胞术分析显示TAE684处理48小时后，凋亡细胞比例增加。RNA-seq分析揭示TAE684处理后DNA损伤相关通路显著改变。Western blot检测到p53、磷酸化p53(p-p53)、p21和γH2AX表达上调。彗星实验显示TAE684处理导致尾矩增长，表明DNA损伤程度加重。免疫荧光检测显示γH2AX焦点形成增加，提示DNA双链断裂。流式细胞术分析显示TAE684引起细胞内ROS水平升高。细胞周期分析表明TAE684诱导明显的G2/M期阻滞。细胞死亡抑制剂联合实验证实，只有凋亡抑制剂Z-VAD-fmk能部分恢复细胞活力，说明凋亡是TAE684诱导细胞死亡的主要形式。

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Fyn抑制引起DNA损伤和G2/M期细胞周期阻滞

通过慢病毒感染构建Fyn敲低的黑色素瘤细胞系，发现Fyn敲低同样导致γH2AX表达上调。彗星实验显示Fyn敲低细胞尾矩增长，免疫荧光检测到γH2AX阳性细胞增加。Fyn敲低细胞中ROS水平升高，并出现明显的G2/M期细胞周期阻滞，与TAE684处理结果一致。

靶向Fyn导致AP-1信号通路抑制

基于RNA-seq数据的GSEA分析显示，TAE684处理导致AP-1信号通路下调。AP-1转录因子核心成分c-Fos和c-Jun在mRNA和蛋白水平均被TAE684下调。Fyn敲低细胞中观察到类似变化。电泳迁移率变动分析(EMSA)显示TAE684处理导致核内c-Jun水平降低。双荧光素酶报告基因实验证实Fyn过上调AP-1启动子活性，而TAE684抑制Fyn并下调AP-1荧光素酶活性。免疫组化显示TAE684处理组肿瘤中c-Jun阳性细胞率浓度依赖性降低。

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TAE684通过介导DNA损伤抑制维莫非尼耐药黑色素瘤细胞的恶性表型

在维莫非尼耐药的A375细胞(RA)中，TAE684显著抑制细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，IC₅₀值为0.7822μM，与亲本A375细胞接近，表明耐药细胞未对TAE684产生交叉耐药。免疫荧光证实TAE684诱导DNA损伤，qPCR和Western blot显示AP-1信号通路下调。Fyn敲低在RA细胞中产生类似效果，并引起G2/M期阻滞。

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靶向Fyn通过抑制AP-1信号通路逆转维莫非尼耐药

Western blot分析显示，与亲本A375细胞相比，RA细胞中c-Jun和c-Fos水平升高，提示AP-1信号通路在维莫非尼获得性耐药中发挥作用。虽然Fyn表达未见明显上调，但免疫沉淀显示其酪氨酸磷酸化水平升高，表明在耐药细胞中激活程度更高。TAE684(0.1μM)与不同浓度维莫非尼联用显著降低RA细胞活力。两药联用最大程度抑制克隆形成。SynergyFinder和Compusyn分析显示两药具有显著协同效应，其中0.1μM TAE684与8μM维莫非尼组合协同得分最高。在RA细胞移植瘤模型中，联合治疗组肿瘤体积显著小于单药治疗组，且对体重无影响。c-Jun过表达使黑色素瘤细胞获得维莫非尼耐药性，进一步证实AP-1信号通路在BRAFi获得性耐药中的关键作用。

研究结论与讨论部分强调，Fyn作为酪氨酸激酶通过磷酸化多种底物调控细胞生长、生存、粘附和运动，在多种癌症发展中起关键作用。本研究首次证实Fyn抑制通过DNA损伤相关机制促进细胞凋亡，并揭示Fyn通过调控AP-1信号通路介导黑色素瘤对维莫非尼的获得性耐药。TAE684作为Fyn抑制剂，不仅能抑制亲本细胞的恶性表型，还能逆转黑色素瘤对维莫非尼的耐药性。

该研究的创新点在于阐明了Fyn抑制诱导凋亡的新机制——通过ROS积累、DNA损伤和G2/M期阻滞，并证实AP-1信号通路在Fyn介导的耐药中的作用。TAE684与维莫非尼的协同作用为临床克服BRAFi耐药提供了新策略。尽管多种Fyn抑制剂已进入临床试验，但多数疗效有限或副作用明显。TAE684作为新型Fyn抑制剂，其疗效和安全性值得进一步评估。

值得注意的是，Fyn抑制可能通过下调AP-1通路促进ROS产生和DNA损伤。AP-1调节多种下游靶基因，如硫氧还蛋白、REDD1、TREX1等，在细胞氧化应激防御中起重要作用。同时，AP-1信号通路是MAPK级联反应激活的关键下游通路，在BRAFi耐药中发挥核心作用。本研究为理解BRAFi耐药机制提供了新视角，并为联合靶向治疗提供了实验依据。

总之，本研究首次证明Fyn抑制通过DNA损伤相关机制促进细胞凋亡，并阐明Fyn通过调节AP-1信号通路促进黑色素瘤对维莫非尼的获得性耐药。TAE684作为Fyn抑制剂，能抑制亲本细胞的恶性表型，并逆转维莫非尼耐药。TAE684与维莫非尼的联合使用为未来治疗BRAFi耐药黑色素瘤提供了有前景的策略。