通过定向进化增强O-连接寡糖转移酶的功能性

《Journal of Biological Chemistry》：Enhancing O-linking oligosaccharyltransferase functionality through directed evolution

本研究通过定向进化优化O-连接 oligosaccharyltransferase（OTase） PglS，以提高GBS多糖与载体蛋白的共价结合效率。筛选出T268F和K312E双突变体及N28W T268F K312E三突变体，质谱分析显示这些变体不仅单糖基化，还能在载体蛋白的两个独立丝氨酸位点（Ser9和Ser12）实现双糖基化，显著提升多糖结合比，为规模化疫苗生产奠定基础。

　　在现代生物医学研究中，疫苗开发是一个至关重要的领域，尤其在对抗细菌感染方面。随着科学技术的进步，科学家们不断探索新的方法以提高疫苗的生产效率和免疫效果。近年来，一种基于生物偶联技术的疫苗研发策略引起了广泛关注，这种技术利用特定的酶来将多糖与蛋白质载体偶联，从而生成具有更高免疫原性的糖蛋白复合物。在这一背景下，研究团队发现了一种名为PglS的寡糖基转移酶，它在转移多糖至蛋白质载体方面表现出广泛的底物适应性，为下一代疫苗开发提供了有吸引力的工具。然而，这种酶在不同多糖底物上的转移效率存在差异，因此提高糖基化效率，以生产高度糖基化的载体蛋白，成为实现大规模疫苗生产的重点。

研究团队通过定向进化策略，针对PglS进行了系统性的改造，旨在提高其对特定多糖（如GBSV多糖）的偶联效率。GBSV多糖是引起新生儿早发性疾病的常见病原体之一，同时也是非妊娠成人中最具侵袭性的多糖之一。为了实现这一目标，研究人员首先利用AlphaFold预测的PglS结构模型，确定了可能影响催化反应和底物进入的关键区域。随后，他们采用了一种称为“22c-trick”的饱和突变方法，对这些区域进行突变筛选。这种方法通过减少遗传密码的冗余性，降低了筛选工作量，提高了效率。

通过这一方法，研究团队成功筛选出28种PglS突变体，这些突变体在GBSV多糖偶联效率上均优于野生型PglS。其中，一些突变体表现出显著的提升，例如在特定位置引入的氨基酸替换，如T268F和K312E，能够显著增强多糖转移效率。为了进一步优化这些突变体，研究团队进行了组合突变分析，发现某些氨基酸替换的组合可以带来更显著的提升效果。例如，双突变体T268F K312E的偶联效率比单突变体提高了近三倍，而三突变体N28W T268F K312E的效率更是达到了更高的水平。

在实验过程中，研究人员采用了多种方法来验证这些突变体的性能。其中，ELISA（酶联免疫吸附测定）被用于评估不同PglS突变体对多糖转移效率的影响。通过ELISA，他们能够定量分析多糖偶联到载体蛋白的程度，并确定哪些突变体在转移效率上表现最佳。此外，质谱分析也被用来验证糖基化事件的准确性和定量，以确保突变体在多糖转移过程中的稳定性。

研究团队还发现，某些PglS突变体不仅能够提高多糖的转移效率，还能够对载体蛋白中的多个糖基化位点进行偶联。这一现象在野生型PglS中并未观察到，表明这些突变体可能具有独特的糖基化机制。这种双重糖基化能力显著提升了最终生成的糖蛋白复合物的多糖-蛋白质比例，从而提高了疫苗的免疫原性和生产效率。

为了进一步验证这些突变体的实用性，研究团队还设计了包含多个糖基化位点的载体蛋白EPA6。与传统的EPA2载体蛋白相比，EPA6的结构设计使其能够更好地展示抗原，从而增强免疫反应。实验结果显示，使用EPA6作为载体蛋白时，经过优化的PglS突变体能够显著提高多糖的偶联效率，甚至在某些情况下达到3.5倍的提升。这些数据表明，经过优化的PglS突变体不仅适用于GBSV多糖的偶联，还可能适用于其他细菌多糖的偶联，为未来的疫苗开发提供了广阔的应用前景。

此外，研究团队还探讨了这些突变体在实际生产中的应用潜力。通过大规模发酵和纯化，他们能够评估突变体在实际生产条件下的表现。实验结果表明，这些突变体在提高多糖偶联效率的同时，也保持了较高的蛋白质表达水平，从而确保了疫苗的稳定性和可扩展性。这一发现对于推动生物偶联疫苗的大规模生产具有重要意义。

为了确保实验的准确性和可重复性，研究团队采用了多种验证方法，包括Western blotting和质谱分析。Western blotting用于检测PglS突变体的表达水平，而质谱分析则用于确认糖基化事件的发生和定量。这些方法的结合使得研究人员能够全面评估突变体的性能，并确保实验结果的可靠性。

研究还指出，虽然PglS在糖基化效率上表现出色，但其在实际应用中仍面临一些挑战。例如，某些氨基酸替换可能会影响酶的结构稳定性，从而降低其活性。因此，研究人员需要在提高糖基化效率的同时，确保酶的稳定性和功能性。此外，某些突变体可能在特定条件下表现出不同的效果，这需要进一步的实验验证。

在这一研究中，研究人员还探讨了定向进化方法在糖基化酶优化中的应用。通过系统性的突变筛选和组合分析，他们能够快速找到最优的氨基酸替换组合，从而显著提高糖基化效率。这种方法不仅适用于PglS，还可能推广到其他糖基化酶的优化中，为未来的生物偶联技术提供新的思路和工具。

总体而言，这项研究为生物偶联疫苗的开发提供了重要的理论基础和技术支持。通过优化PglS的活性，研究人员成功提高了多糖-蛋白质偶联效率，这不仅有助于提高疫苗的免疫原性，还为大规模生产提供了可能。此外，研究团队还发现了一些新的糖基化机制，这些发现可能对其他糖基化酶的优化产生启发。随着生物技术的不断进步，这些研究成果有望在未来的疫苗开发中发挥重要作用，为人类健康做出更大的贡献。