使用热解吸气相色谱法结合平行质谱和离子迁移谱检测技术分析肺炎病原体的挥发性有机化合物谱型：一项可行性研究

《Journal of Chromatography A》：Volatile organic compound profiles of pneumonia pathogens using thermal desorption gas chromatography with parallel mass and ion mobility spectrometry detection: A feasibility study

医院获得性肺炎（HAP）和呼吸机相关性肺炎（VAP）的快速病原体鉴定是临床挑战。本研究开发了整合热脱附-气相色谱-质谱-离子迁移谱（TD-GC-MS-IMS）的一体化平台，通过标准化培养条件下的挥发性有机物（VOCs）时间分辨分析，识别了五种临床相关病原体的特异性VOCs：大肠杆菌（indole）、金黄色葡萄球菌（2,3-丁二酮、醋酸oin、2-甲基丁醛）、铜绿假单胞菌（甲基硫氰酸酯）、鲍曼不动杆菌（二甲基二硫醚及未鉴定化合物UK_1）。混合培养实验证实这些VOCs在复杂微生物环境中仍保持特异性，为开发基于VOCs的快速诊断工具提供了可靠数据库支持。

　　医院获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎是重症监护病房中极具威胁的感染类型，尽管快速识别病原体仍然是一个诊断挑战。挥发性有机化合物（VOCs）由细菌释放，若能建立可靠的物种相关VOC特征，可能支持替代性诊断策略。本研究采用热脱附-气相色谱-质谱-离子迁移谱（TD-GC-MS-IMS）平台，用于表征临床相关肺炎病原体的时间分辨VOC特征。研究中对几种临床相关病原体进行了培养，并使用定制的采样系统在24小时内采集了头空间样本。双检测器设置使得保留时间、漂移时间和质谱信号的直接关联成为可能，从而支持可靠化合物的识别和确认。研究中识别出了一些与特定病原体相关的VOCs，例如大肠杆菌释放的吲哚，金黄色葡萄球菌释放的丙酮和支链醛，铜绿假单胞菌释放的甲基硫氰酸和二甲基二硫，以及鲍曼不动杆菌释放的二甲基二硫和一个IMS特异性未知化合物。这些标志物在定义的混合培养中仍然可以检测到，表明它们在更复杂的条件下具有较强的稳定性。研究结果突显了基于VOC的诊断方法的潜力及其当前局限性，提供了一个经过验证的参考框架，有助于开发GC-IMS数据库以及未来临床呼吸样本的转化研究。

医院获得性肺炎（HAP）是一种严重的肺部感染，通常发生在住院超过48小时后，由临床环境中存在的细菌引起。作为最常见的院内感染之一，它对重症监护病房的患者构成特殊威胁，常伴随高死亡率，并可能需要气管插管和机械通气等干预措施。除了增加医疗成本和延长住院时间外，HAP还可能导致危及生命的并发症，如败血症、急性呼吸窘迫综合征或多器官衰竭。HAP的估计发生率约为每100名住院患者1例，粗死亡率在13%至30%之间。其中，一种特别关键的HAP形式是呼吸机相关性肺炎（VAP），它发生在接受侵入性机械通气超过48小时的患者中，与更高的死亡率相关，通常超过30%。

早期和针对性的抗生素治疗对于改善HAP患者的预后至关重要。然而，识别病原体仍然是一个耗时的过程，通常需要数天时间。因此，症状出现时会采用广谱抗生素的经验性治疗，虽然这种方法可能挽救生命，但同时也加剧了抗菌药物耐药性的增长。诊断的确定性还受到临床、实验室和影像学发现的特异性不足的限制，以及不同临床医生对这些发现的解释存在显著差异。在缺乏快速微生物学结果的情况下，治疗决策必须依赖于个体风险评估和当地的流行病学数据，这可能并不总是能准确反映感染的真实病因。最终的微生物学确认通常通过支气管肺泡灌洗液、气管内吸出物或保护性标本刷样本获得，仍是诊断的黄金标准。然而，这些程序具有侵入性且耗时，难以在早期指导治疗决策。尽管传统培养、聚合酶链反应和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等方法在准确识别方面具有优势，但它们在急性护理环境中往往因设备的有限可得性、复杂性和延迟的周转时间而不切实际。特别是，虽然MALDI-TOF-MS能够通过细菌蛋白谱快速识别，但仍然需要先进行培养，这仍然是一个耗时的过程，限制了其在早期诊断中的应用。这些限制凸显了在早期检测HAP方面亟需一种快速、非侵入性和可靠的诊断方法。

一种有前景的诊断方法是微生物挥发性有机化合物（mVOCs）的分析，这些是细菌在生长和感染过程中释放的代谢产物。这些化合物种类繁多，包括醇类、酮类、醛类、酸类、酯类和碳氢化合物，其中许多具有足够的挥发性，可以被检测到。由于它们直接排放到周围环境中，可以非侵入性地从细菌培养的头空间或甚至从呼出的呼吸中采样，这使它们成为诊断应用的极具吸引力的选项。为了捕获和识别这些挥发物，研究人员采用了多种分析技术。其中，气相色谱-质谱（GC-MS）因其对VOC分析的全面性和高灵敏度而被广泛认可，能够通过质谱特征识别单个化合物。近年来，气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）因其快速和灵敏的特性而受到关注，尤其适用于分析复杂的气体混合物，并因其便携性和易于操作而具有在床边诊断的潜力。这两种方法在区分病原体物种方面都已被成功应用于mVOC的特征分析。近年来，许多体外和体内研究显示，不同细菌物种释放的mVOC特征各异，可以用于区分临床相关的病原体，包括与HAP相关的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌。例如，Kunze-Szikszay等人研究了临床相关HAP病原体释放的mVOC模式是否可以通过IMS与多毛细管柱（MCC-IMS）区分。他们的体外研究显示，在仅需6小时的培养后，就可以可靠地根据其mVOC特征区分包括上述三种HAP病原体在内的11种细菌。除了这项研究，还有其他几项研究探索了GC-IMS在分析细菌VOC特征方面的应用，旨在区分不同物种。许多这些研究没有识别出所选的VOC信号，但仍然使用统计方法尝试通过未识别的VOC进行物种区分。这种做法被认为是有问题的，因为明确的化合物识别对于排除其他来源和确认真正的细菌来源至关重要。

尽管这些研究突出了GC-IMS在物种水平区分上的潜力，但当检测到的VOCs未被结构识别时，其解释能力仍然有限。缺乏化合物确认是生物标志物验证的主要障碍，也限制了结果在不同实验室间的可重复性。大多数基于GC-IMS的方法共享一个核心技术限制，即难以结构识别未知化合物，这主要归因于缺乏全面的离子迁移谱库。这一问题在生物标志物发现的背景下尤为关键，因为无歧义的识别对于评估生物来源和诊断相关性至关重要。例如，人类的呼出气体中含有超过500种挥发性化合物，其中许多与微生物代谢无关，而是来自外源性来源，如饮食或环境。因此，核心挑战在于识别那些真正反映感染期间细菌活动的VOCs。

虽然未靶向的VOC分析仍然是常见的策略，但IMS研究中的化合物识别通常依赖于仪器特定的参考库。这些参考库通常依赖于保留时间和漂移时间索引，这些索引往往来自于酮类校准标准，而不是像MS方法中那样使用的公开可用的光谱数据库。这些初步匹配容易因仪器差异、条件变化和光谱分辨率不同而导致误识别。因此，可靠的化合物识别——理想情况下是通过在相同分析条件下与纯参考物质进行比较——是实现有意义的解释和临床转化的前提。如果没有这一步骤，基于mVOC分析的诊断潜力将局限于探索性应用，而不是可靠的、可操作的临床工具。

为了解决基于GC-IMS研究中的化合物识别问题，一些研究人员采用了靶向策略：通过文献回顾建立自定义物质库，使用真实参考标准进行识别。例如，Gallegos等人研究了使用GC-IMS区分不同乳酸菌（LAB）的挥发性代谢物特征。在该研究中，特定的mVOCs如丁酮、戊酮、庚酮和3-甲基-1-丁醇被识别为区分与奶酪生产相关的四种LAB菌株的关键标志物。虽然这些靶向库可以在特定环境中提高识别能力，但其适用范围狭窄，且临床相关病原体的全面参考数据仍然缺乏。

尽管GC-IMS系统具有诸多优势，特别是其在现场使用的潜力和用户友好的操作方式，但化合物识别仍主要依赖于仪器特定的参考数据库，这些数据库通常在范围和标准化方面存在局限。因此，许多研究仍然依赖于GC-MS进行可靠的VOC识别。一些TD-GC-MS和HS-GC-MS研究已经展示了这一优势，通过在标准化条件下识别和验证细菌VOC标志物。例如，Filipiak等人研究了GC-MS在VAP的体外识别和体内验证VOC标志物的应用。他们首先在标准化培养条件下筛选了四种常见的VAP病原体（鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌）的mVOC排放，然后根据这些结果选择了九种与物种相关的代谢物，并成功验证了危重患者呼出气体样本，使得能够区分感染和未感染的个体。然而，GC-MS系统仍然局限于实验室环境，不太适合床边诊断，这突显了需要结合稳健识别与现场适用性的混合解决方案，例如本文中提出的TD-GC-MS-IMS平台。

为了满足这一需求，我们开发了一种新型的桌面系统，将热脱附（TD）、气相色谱（GC）、质谱（MS）和离子迁移谱（IMS）整合在一个单一的平台（TD-GC-MS-IMS）中。这种双检测器设置使得同时采集保留时间（t_R）、质谱图和漂移时间（t_D）成为可能，从而支持化合物的可靠识别。在先前的研究中，我们已经证明了该系统的长期稳定性和适用于标准化VOC采样的能力，通过一个可移动、流速和温度可控的TD管单元，确保了气体和液体样品的可重复应用。这些发展构成了本研究的分析基础。

本研究的关键目标是展示TD-GC-MS-IMS系统在建立经过验证的临床相关VOC参考数据集方面的适用性。因此，我们采用了针对细菌培养的头空间采样设置，使其能够在琼脂板上进行培养，从而在定义的条件下进行培养，并实现时间分辨的mVOC收集。该设置被连接到一个可移动的、流速和温度可控的TD管采样系统，以确保头空间挥发物在吸附管上的可重复转移。通过这种方式，我们能够收集高质量的时间分辨VOC数据，并系统地关联保留时间、漂移时间和质谱图。通过将IMS信号与MS结果进行识别，该系统提供了一个可靠的参考框架，结合了GC-MS的稳健识别能力与GC-IMS的操作优势。这种整合弥补了两种技术之间的差异，支持标准化VOC库的开发，并将其转化为可部署的诊断平台，这在肺炎感染的背景下具有特别的意义。

本研究将这一方法应用于五种临床相关的细菌病原体。鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌属于所谓的ESKAPE组（肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌），这些病原体由于抗菌药物耐药性而具有重要的临床意义。大肠杆菌和肺炎链球菌虽然不属于ESKAPE组，但它们在严重的HAP和VAP病例中经常被发现。与之前报道的研究不同，本研究强调了IMS在翻译应用中的针对性使用，为更广泛的GC-IMS应用提供了桥梁，有助于实现稳健的生物标志物发现和可部署的诊断工具的开发。

在本研究中，通过五种病原体的培养，我们观察到了不同的VOCs。这些包括：大肠杆菌释放的吲哚，金黄色葡萄球菌释放的丙酮和支链醛，铜绿假单胞菌释放的甲基硫氰酸和二甲基二硫，鲍曼不动杆菌释放的二甲基二硫和一个IMS特定的未知化合物。在混合培养实验中，这些标志物仍然可以被检测到，这表明它们在更复杂的环境中具有良好的稳定性。我们的发现强调了基于VOC的诊断方法的潜力，同时指出了其当前的局限性，为未来的研究提供了经过验证的参考框架，支持GC-IMS数据库的开发和临床转化研究。

尽管基于VOC的诊断方法在某些方面表现出色，但仍然存在一些挑战。首先，每种病原体测试的菌株数量有限，这限制了标志物特征的普遍适用性，并可能无法完全反映临床分离株的代谢异质性。其次，手动头空间采样限制了时间分辨率，尤其是在早期生长阶段，这可能导致标志物出现时间的不完整记录。第三，虽然大多数标志物可以通过真实的参考标准进行验证，但一些化合物，如甲基硫氰酸和未知化合物（UK_1），仍然需要进一步确认或结构解析，这构成了本研究的一个主要限制。特别是，甲基硫氰酸的识别仅基于NIST图书馆匹配，未通过纯参考物质的分析进行确认。这种初步的归属应当谨慎解读，未来的工作将需要确认该化合物的化学身份和诊断相关性。同样，明确UK_1的化学身份和生物化学来源可能会有助于进一步理解鲍曼不动杆菌的代谢，并支持未来研究中诊断特异性的改进。此外，GC-IMS中绝对信号强度依赖于仪器和系统特定的因素。即使在标准化条件下，报告的值仍然具有研究特定性，需要仪器特定的校准以确保在其他平台上的可转移性。最后，尽管定义的混合培养确认了物种特异性标志物在可控条件下的可检测性，但它们无法完全模拟临床呼吸样本的复杂性，后者通常包含多种微生物群落，包括病原体、共生菌和真菌。在本研究中，病原体是从临床样本中获得的，并随后作为单一或混合菌株进行分析，这提供了机制上的见解，但仍需要将这些结果转化为未处理患者样本的直接测量。因此，未来的研究应关注扩大微生物种类，并将VOC分析直接应用于呼吸样本，以捕捉完整的生物复杂性并缩短诊断时间。

基于这些背景，我们有意将研究矩阵选择得更接近感染部位，而不是呼出的呼吸。作为下一步，将进行一项前瞻性研究，使用相同的TD-GC-MS-IMS方法分析疑似院内肺炎患者的呼吸道拭子和吸出物，旨在在临床条件下验证识别的挥发性标志物。这种方法提供了在几小时内获得临床可操作结果的前景，可以指示可能的病原体组，并为抗生素选择提供早期、基于证据的指导。这可能有助于从广谱抗生素方案中及时降级，提高治疗的适当性，并减少多药耐药菌的选择压力。前瞻性验证患者样本对于确立诊断效用至关重要，但本研究中观察到的性能为进一步的临床评估提供了有力的依据。