经过生物功能化的3D打印明胶-海藻酸盐支架，添加了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽，以增强体外骨形成作用

《Journal of Dental Sciences》：Biofunctionalized 3D-printed gelatin-alginate scaffolds with arginine-glycine-aspartic acid (RGD) peptides for enhanced in vitro osteogenesis

骨组织再生中RGD肽修饰的3D打印明胶-藻酸盐水凝胶的生物相容性与骨形成能力研究。该研究通过整合RGD肽至3D打印的水凝胶材料中，系统评估了材料的孔隙结构、化学组成、肿胀降解特性及体外细胞粘附增殖、分化矿化能力。结果表明，0.5 mg/mL RGD修饰组水凝胶具有最佳结构稳定性（肿胀率20%）和显著促进MG-63成骨细胞粘附（提升42%）、增殖（提升35%）、碱性磷酸酶活性（提升28%）及钙结节沉积（提升26%）。

　　本研究探讨了一种新型的3D生物打印水凝胶支架在牙槽骨修复中的应用。牙槽骨缺陷是临床上常见的问题，其成因包括牙周炎、龋齿、外伤、发育异常或牙齿拔除等。这类缺陷不仅影响牙齿的支持结构，还可能导致持续的骨吸收，进而影响口腔功能、外观以及义齿修复的效果。传统的骨移植材料如自体骨、异体骨、异种骨或合成材料在长期效果上存在局限，例如吸收控制不足、免疫反应和形成非活性、疤痕样骨组织等问题。此外，复杂的缺损形态、较差的骨质量以及感染风险也增加了治疗难度。因此，寻找能够有效促进牙槽骨再生的先进生物材料成为现代牙科治疗的重要目标。

在这一背景下，组织工程和再生医学（TERM）作为一种替代方案，为骨组织修复提供了新的可能性。组织工程策略通常结合支架、细胞和生长因子，以构建能够促进组织修复和再生的结构。其中，水凝胶因其良好的生物相容性、可降解性和能够模拟细胞外基质（ECM）的特性，成为一种备受关注的支架材料。水凝胶具有可调的物理和生物特性，如交联密度、降解速率和载药释放能力，使其在牙槽骨再生中具有广泛应用前景。通过3D打印技术，可以将水凝胶材料精确地构建成符合患者需求的多相结构，从而提升支架设计的精度和适应性。

本研究的重点是开发一种由RGD肽修饰的3D打印的明胶-海藻酸盐水凝胶支架，以增强其生物活性和成骨能力，从而实现更有效的牙槽骨修复。RGD肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）是一种广泛存在于细胞外基质中的细胞粘附序列，能够通过与细胞表面的整合素受体结合，促进细胞的粘附、增殖和分化。将RGD肽引入水凝胶网络中，可以弥补传统水凝胶在生物活性方面的不足，从而增强细胞与材料之间的相互作用。本研究采用了一种浸渍修饰法，将不同浓度的RGD肽（0.25 mg/mL和0.5 mg/mL）引入明胶-海藻酸盐水凝胶中，以评估其对细胞行为的影响。

在材料制备方面，研究首先将明胶粉末溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，加热至37℃以确保溶液的均匀性。随后，将海藻酸盐粉末加入明胶溶液中，形成明胶-海藻酸盐混合物。为了进行3D打印，该混合物被加载至注射器中，并通过生物打印机进行精确打印。打印过程中，采用了一种22G喷嘴，并在37℃的环境下进行，以确保材料的稳定性。打印完成后，支架在100 mM CaCl?溶液中进行交联处理，以增强其机械强度和结构稳定性。交联后的支架经过多次PBS清洗，以去除残留的CaCl?，并确保其结构的完整性。随后，通过浸渍法将RGD肽引入支架中，使其在不同浓度下与水凝胶基质结合。

在物理和化学特性分析方面，研究通过扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）对支架的表面形态和元素组成进行了评估。SEM图像显示，RGD肽修饰的支架具有规则且相互连通的多孔结构，而EDS分析则进一步验证了RGD肽的引入。结果显示，随着RGD肽浓度的增加，氮和氧的含量显著上升，而碳的比例有所下降。这表明RGD肽成功地被引入到水凝胶基质中，并且其分子结构中的氮和氧原子对支架的化学特性产生了影响。此外，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析也确认了RGD肽的引入对水凝胶化学结构的改变。在FTIR光谱中，出现了新的吸收峰，如C–H伸缩振动峰（2846 cm?1和2915 cm?1），以及酰胺II带的移动（从1580 cm?1移至1540 cm?1），这些变化与RGD肽的引入密切相关。

在支架的肿胀和降解特性方面，研究发现RGD肽修饰的明胶-海藻酸盐支架表现出稳定的肿胀行为和较低的降解速率。相较于未修饰的明胶-海藻酸盐支架，RGD肽修饰的支架在不同时间点的肿胀率均保持正向增长，且降解率显著降低。这一特性对于牙槽骨修复尤为重要，因为支架需要在体内保持结构完整性，同时允许细胞迁移和组织再生。肿胀率的稳定增长表明支架能够有效吸收细胞培养液，维持细胞所需的湿润环境，从而促进细胞的生长和分化。

在生物学性能评估方面，研究采用了MG-63细胞作为模型，以评估RGD肽修饰支架对细胞行为的影响。细胞粘附实验通过免疫荧光显微镜观察细胞在支架表面的附着情况。结果显示，RGD肽修饰的支架显著提高了MG-63细胞的粘附能力，尤其是在0.5 mg/mL浓度下，细胞密度和扩展程度明显优于未修饰组。细胞增殖能力则通过Alamar Blue法进行评估，该方法通过测量细胞代谢活性来反映细胞的生长状态。实验结果表明，RGD肽修饰的支架能够显著促进MG-63细胞的增殖，尤其是在0.5 mg/mL浓度下，细胞增殖速率明显提高。然而，0.25 mg/mL和0.5 mg/mL浓度的RGD肽修饰支架之间没有显著差异，这表明即使较低浓度的RGD肽也能够提供足够的生物活性以支持细胞的扩展。

在细胞分化能力方面，研究通过碱性磷酸酶（ALP）活性测定评估了RGD肽修饰支架对成骨细胞分化的影响。ALP活性是成骨细胞分化的关键标志之一，实验结果显示，RGD肽修饰的支架在第7天和第14天均表现出显著的ALP活性提升，尤其是在0.5 mg/mL浓度下，ALP活性比0.25 mg/mL组更高。这一结果表明，RGD肽的引入不仅促进了细胞的初始粘附，还通过调控细胞微环境，增强了细胞的分化能力。此外，细胞矿化能力则通过茜素红S（ARS）染色进行评估。染色结果显示，RGD肽修饰的支架在矿化过程中表现出更强的染色强度，尤其是在0.5 mg/mL浓度下，矿化程度显著提高。这表明RGD肽的引入不仅有助于细胞的粘附和增殖，还能有效促进细胞的矿化能力，从而支持骨组织的形成。

本研究的结果表明，RGD肽的修饰显著提升了3D打印明胶-海藻酸盐水凝胶支架的结构和生物性能。支架的多孔结构和元素组成的变化进一步证明了RGD肽的成功引入。同时，支架的稳定肿胀和低降解率为其在体内应用提供了良好的基础。在细胞行为方面，RGD肽修饰的支架能够显著增强MG-63细胞的粘附、增殖和分化能力，尤其是在0.5 mg/mL浓度下，细胞活性和矿化能力均达到最佳状态。这些结果表明，RGD肽的引入不仅改善了支架的物理和化学特性，还通过调控细胞行为，增强了其在牙槽骨再生中的应用潜力。

从临床角度来看，RGD肽修饰的明胶-海藻酸盐水凝胶支架为牙槽骨修复提供了一种新的解决方案。传统的骨移植材料在长期应用中存在诸多问题，如吸收控制不足、免疫反应和形成非活性骨组织等。而RGD肽修饰的支架能够有效解决这些问题，因为它不仅提供了良好的机械支撑，还能通过调控细胞行为促进骨组织的形成。此外，该支架的多孔结构有助于营养物质的运输和细胞的迁移，从而加速组织再生过程。同时，支架的可打印性和可注射性使其在复杂牙槽骨缺损的修复中具有更高的适应性和操作性，减少了二次手术的需要。

在组织工程领域，RGD肽修饰的水凝胶支架已被广泛研究，并显示出在多种生物应用中的潜力。例如，RGD肽能够增强细胞的粘附能力，促进细胞的增殖和分化，从而支持组织的再生。此外，RGD肽的引入还可以改善支架的生物活性，使其能够更有效地模拟天然细胞外基质的特性。这些特性使得RGD肽修饰的支架在牙槽骨修复中具有重要的应用价值。同时，该研究还表明，RGD肽的浓度对支架性能有显著影响，尤其是在促进细胞分化和矿化方面，0.5 mg/mL浓度的RGD肽表现出更优的性能。

综上所述，本研究通过将RGD肽引入3D打印的明胶-海藻酸盐水凝胶支架中，成功提升了其生物活性和成骨能力。支架的多孔结构、元素组成的变化以及细胞行为的改善均表明其在牙槽骨修复中的应用潜力。未来的研究可以进一步优化RGD肽的浓度和修饰方法，以提高支架的性能。此外，还可以探索RGD肽与其他生物活性分子的结合，以增强支架的多功能性。这些努力将有助于开发更高效的牙槽骨修复材料，为临床治疗提供新的选择。