在德国，通过使用一种高灵敏度的扩增子测序方法，献血者被作为监测西尼罗河病毒基因组的“哨兵”

《Journal of Infection》：Blood donors as sentinels for genomic surveillance of West Nile virus in Germany using a sensitive amplicon-based sequencing approach

基因组测序技术优化及德国西尼罗病毒亚克隆群与传播动态研究

　　西尼罗病毒（West Nile Virus, WNV）作为一种通过蚊虫传播的正黄病毒科病毒，近年来在德国成为公共卫生关注的重点。自2018年首次在德国境内检测到该病毒以来，其传播范围逐渐扩大，特别是在鸟类、马匹和人类中出现了本地传播的迹象。随着病毒活动的增加，WNV已成为欧洲多个地区引起病毒性脑炎的重要病原体。然而，WNV在人类感染中的病毒血症通常较低且短暂，这给病毒的诊断和监测带来了挑战。传统的核酸检测（NAT）方法在病毒血症初期具有较高的灵敏度，但在后期或症状较轻的感染中可能无法有效检测病毒。此外，血清学检测虽然在某些情况下具有应用价值，但其局限性在于与其他正黄病毒的交叉反应以及IgM抗体的长期存在，这些因素都可能影响检测结果的准确性。因此，对于低病毒载量样本，尤其是来自血库的样本，实现病毒基因组的高效回收仍然是一个技术难题。

为了解决这一问题，本研究提出了一种新的、高度敏感的基于扩增子的测序方法，专门用于WNV谱系2的全基因组测序。该方法通过设计特定的引物方案，优化了从低病毒载量样本中提取病毒基因组的能力。研究团队使用了43份在2020年至2024年间通过核酸检测确认为WNV阳性的血库样本，这些样本来自德国多个血库。通过对这些样本的分析，研究团队成功回收了30份基因组序列，其中部分样本达到了接近完整的基因组覆盖度（80-99%），而其余样本则至少覆盖了70%的基因组区域。这些结果表明，该方法在处理低病毒载量样本时具有显著优势，能够在更广泛的病毒浓度范围内实现可靠的基因组回收。

研究团队进一步将该方法与基于宏基因组的下一代测序（mNGS）进行了比较。结果显示，基于扩增子的测序方法在低病毒载量样本中的表现优于mNGS。在1倍覆盖度下，基于扩增子的方法能够从低于10个RNA拷贝/微升的样本中回收病毒基因组，而mNGS则需要至少100个RNA拷贝/微升才能实现完整的基因组回收。这种更高的灵敏度使得基于扩增子的测序方法更适合用于血库样本的基因组回收，从而支持更广泛的病毒监测和分子流行病学研究。

通过对这些基因组序列的分析，研究团队发现德国境内的WNV谱系2病毒存在六个不同的亚群（2A–2F）。这些亚群主要来源于中欧地区，特别是奥地利和斯洛伐克。其中，亚群2F在德国占据了主导地位，并且在多个联邦州中广泛传播。研究还发现，柏林、勃兰登堡、萨克森和萨克森-安哈尔特是WNV传播的主要枢纽，这些地区不仅出现了多次的病毒检测，而且在基因组分析中显示出较强的遗传关联性。这些发现为理解WNV在德国的传播模式和地理扩散提供了重要的线索。

此外，研究团队利用连续的病毒地理模型和离散的特征分析方法，对WNV的传播路径进行了重建。结果表明，德国的WNV传播可能源于多个独立的引入事件，而非单一的输入后本地演化。这种模式与之前的研究结果不同，表明WNV在德国的传播历史可能比预期的更为复杂。模型还指出，某些亚群如2A、2C、2E和2F显示出时间上的持续性和地理上的扩展，这可能意味着这些亚群在德国境内已经建立了稳定的本地传播链。相比之下，亚群2B和2C的传播似乎较为短暂，可能未能在德国建立持续的本地传播。

本研究还强调了血库作为WNV监测的重要哨兵角色。血库样本的系统收集、广泛的地理分布以及高灵敏度的核酸检测，使得血库成为早期发现WNV传播的有力工具。通过将基于扩增子的测序方法与血库筛查相结合，可以实现对WNV传播的全面监测，不仅有助于早期检测，还能提供关于病毒传播路径和本地演化的重要信息。这种结合方法为德国乃至整个欧洲的公共卫生系统提供了更强大的监测工具，能够支持更有效的病毒防控策略。

研究团队在方法学上进行了充分的优化和验证，确保其适用于多种实验室条件和不同的测序平台。该方法在Illumina iSeq100平台上进行了测试，并且被设计为适用于所有支持2×150 bp测序的Illumina平台。这种兼容性使得该方法在不同实验室之间具有可推广性，同时也为大规模或群体级别的研究提供了便利。此外，研究团队还开发了标准化的样本处理流程和生物信息学分析工具，以提高不同实验室间数据的一致性和可靠性。

在讨论部分，研究团队指出，尽管血库样本可能无法完全代表整个社区的WNV传播情况，但它们仍然为监测提供了有价值的视角。特别是，血库样本的地理分布和时间密度，使得它们能够提前发现WNV的传播趋势，为公共卫生部门提供早期预警。此外，研究团队还提到，某些样本的旅行历史信息缺失，这可能影响对感染来源的准确判断。因此，建议在未来的监测工作中，对所有WNV阳性血库样本进行系统性的旅行史记录，以提高数据的解析能力和流行病学研究的深度。

最后，研究团队强调了该方法在应对气候变化带来的挑战方面的潜在价值。随着全球气温上升和蚊虫活动季节的延长，WNV的传播范围和强度可能会进一步扩大。因此，建立高效的病毒监测体系对于预防和控制WNV的传播至关重要。本研究提出的基于扩增子的测序方法不仅适用于当前的监测需求，也为未来可能的病毒扩散提供了科学依据和技术支持。通过整合这种方法，德国的公共卫生系统可以更有效地应对WNV的威胁，保护公众健康。