一种新型的高通量筛选策略，用于鉴定高效黄嘌呤氧化酶抑制肽

《Journal of Molecular Structure》：A novel high-throughput screening strategy for identification of highly active xanthine oxidase inhibitory peptides

XO抑制肽高通量筛选策略创新研究。通过整合ΔG值、分子尺寸及相互作用分析，解决了仅依赖ΔG筛选的不足。从黄瓜花叶病毒蛋白库获得13个高ΔG候选肽，但实际抑制效果最好的TNDW肽浓度为10.0 mg/ml时抑制率仅24%。改进策略从人类母乳蛋白中筛选出11种含色氨酸的二肽，IC50值9.8-18.6 μM，分子动力学模拟证实其与XO结合更稳定。该策略验证了多参数协同筛选的有效性，为天然XO抑制剂开发提供新方法。

　　本研究提出了一种全新的高通量计算机模拟筛选策略，用于识别具有显著黄嘌呤氧化酶（XO）抑制作用的活性肽。传统的筛选方法仅依赖于分子结合自由能（ΔG）来评估潜在的XO抑制肽，然而，这种方法存在一定的局限性。例如，虽然有十三种来自某种生物体（如C. vulgaris）的肽在ΔG指标上表现出较高的预测活性，但其中一种肽TNDW在10.0 mg/ml浓度下仅实现了24%的XO抑制效果。这表明，单纯依赖ΔG值无法准确预测所有具有实际抑制作用的肽，因此需要引入更为全面的筛选标准。

为了解决这一问题，研究团队结合了多种因素，包括分子对接计算得到的ΔG值、肽与XO活性位点之间的相互作用分析，以及肽的分子大小。这些因素被综合考虑，以更精确地筛选出具有潜在抑制作用的肽。基于这种更新的筛选策略，从人类乳蛋白中筛选出了一系列含有色氨酸（Trp）的二肽，这些二肽的XO抑制半数有效浓度（IC50）值在9.8至18.6 μM之间。这一结果表明，新的筛选策略在识别高效XO抑制肽方面具有显著优势。

为了验证这一策略的有效性，研究团队进一步进行了体外实验，评估了所筛选出肽的实际抑制效果。此外，通过分子动力学模拟，研究人员深入分析了这些二肽与XO结合的稳定性，从而揭示了其高效抑制的机制。这些研究结果不仅验证了新策略的准确性，还强调了色氨酸在XO抑制中的重要作用。这种综合性的方法为发现新型、高效的XO抑制剂提供了新的思路，有助于开发更安全、更有效的药物或功能性食品。

黄嘌呤氧化酶（XO）在嘌呤代谢过程中扮演着关键角色，其主要功能是催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤，再进一步转化为尿酸（UA）。XO的异常活动会导致血清尿酸水平升高，进而引发高尿酸血症和痛风等疾病。因此，XO成为治疗高尿酸血症和痛风的重要靶点。然而，目前用于治疗这些疾病的药物如阿洛普尿素（allopurinol）和非布司他（febuxostat）虽然有效，但长期使用可能伴随严重的副作用，如肾毒性、过敏反应、血管炎和史蒂文斯-约翰逊综合征等。这促使研究者寻找更安全、副作用更少的替代方案。

近年来，食品来源的生物活性肽因其较低的副作用和良好的生物相容性而受到广泛关注。这些肽可以从多种食物来源中提取，如鸡蛋、大米、核桃、金枪鱼和鲣鱼等。研究发现，这些肽具有多种生物活性，包括抗氧化、抗糖尿病、抗高血压、降胆固醇、调节食欲、抗炎、保肝、免疫调节和抗菌等。与传统的药物相比，某些天然的XO抑制肽因其高安全性和易吸收性而成为研究的热点。例如，从核桃水解物中分离出的WPPKN和ADIYTE二肽，其IC50值分别为24.91±0.17 mM和23.74±0.29 mM；从乳清蛋白中提取的PEW和LLW二肽，其IC50值分别为3.46±0.22 mM和3.02±0.17 mM；从金枪鱼蛋白水解物中分离出的FH二肽，其IC50值为25.7 mM；从太平洋白虾中筛选出的YNITGW五肽，其IC50值为9.78±0.13 mM。这些研究结果表明，通过计算机模拟筛选获得的活性肽在抑制XO方面具有良好的潜力。

然而，传统的方法在从复杂的食物成分中提取生物活性肽时，常常面临效率低下的问题。提取、分离和纯化过程可能导致许多潜在的活性肽被遗漏或损失。因此，随着生物信息学技术的发展，分子对接等虚拟筛选方法逐渐成为研究生物活性肽的重要工具。例如，通过分子对接技术，研究人员从金枪鱼蛋白中筛选出了一种四肽EEAK，其IC50值为173 μM；从鸡蛋清中筛选出的三肽EEK，在0.5 mg/ml浓度下实现了73.8%的XO抑制效果；从α-乳白蛋白和β-乳球蛋白中筛选出的四种二肽GL、PM、AL和AM，其IC50值分别为10.20 mM、23.82 mM、34.49 mM和40.45 mM。这些研究结果表明，虚拟筛选技术在发现新型XO抑制肽方面具有较高的效率和可行性。

尽管乳源生物活性肽的研究已取得一定进展，但目前尚未有文献报道来自人类乳蛋白的肽具有抗高尿酸血症的活性。这可能与人类乳蛋白的结构和组成特点有关。为了填补这一研究空白，本研究采用了一种精细的计算机模拟高通量筛选策略，旨在识别出具有显著XO抑制作用的肽。该策略首先基于ΔG值对来自C. vulgaris的肽进行初步筛选，然后结合分子对接、肽与XO活性位点之间的相互作用分析以及肽的分子大小等因素，对来自人类乳蛋白的肽进行更全面的评估。最终，通过体外实验验证了所筛选出肽的实际抑制效果，并利用分子动力学模拟进一步揭示了其高效抑制的机制。

为了确保筛选过程的科学性和准确性，研究人员对实验所用的化学试剂进行了详细说明。XO（从牛乳中分离）及其底物黄嘌呤（纯度≥99.0%）由Sigma-Aldrich公司提供。实验中使用的黄嘌呤溶液（0.5 mM）以磷酸盐缓冲液（PBS，20 mM，pH 7.4）为溶剂，并在使用前新鲜配制。所有肽（纯度≥95.0%）由Synpeptide Co., Ltd.公司合成并提供。此外，研究中使用的所有其他化学品均为分析级，以确保实验结果的可靠性。

在进行计算机模拟的蛋白质水解分析时，研究人员收集了C. vulgaris的蛋白质序列，并通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）获取了相关的数据。这些数据为后续的计算机模拟提供了基础信息。通过模拟酶解过程，研究人员生成了一个包含2,362种肽的库，其中包括重复和非重复的序列。该肽库中大多数肽的ΔG值分布在-9至-8 kcal/mol以及-8至-7 kcal/mol之间，其中三肽最为丰富，其次是四肽（图1B）。这一结果表明，ΔG值是评估肽与XO结合能力的重要指标，但并非唯一标准。例如，常用的药物阿洛普尿素的ΔG值为-6.2 kcal/mol，而某些天然的植物化学物质则表现出不同的结合特性。

通过引入多种评估指标，本研究的筛选策略不仅提高了XO抑制肽的识别效率，还有效克服了传统方法的局限性。具体而言，研究团队在筛选过程中考虑了肽与XO活性位点之间的相互作用，包括氢键、疏水作用和静电相互作用等。这些相互作用对于肽与酶的结合稳定性至关重要。此外，肽的分子大小也被纳入评估体系，因为XO的活性位点具有特定的结构特征，可能限制了某些肽的结合能力。因此，综合考虑ΔG值、相互作用分析和分子大小等因素，能够更准确地预测肽的XO抑制潜力。

在体外实验中，研究人员对所筛选出的肽进行了抑制活性的测定。实验结果表明，含有色氨酸的二肽表现出显著的XO抑制作用，其IC50值均在较低范围内。这表明，色氨酸可能在XO抑制过程中发挥关键作用。为了进一步验证这一假设，研究团队还进行了分子动力学模拟，以观察这些二肽与XO结合后的稳定性。模拟结果显示，这些二肽能够与XO形成较为稳定的结合，从而实现高效的抑制作用。这一发现为理解XO抑制的分子机制提供了重要的线索。

本研究的结论表明，整合ΔG值、肽与XO活性位点之间的相互作用分析以及肽的分子大小，能够显著提高XO抑制肽的筛选效率和准确性。传统的仅依赖ΔG值的筛选方法在某些情况下可能无法准确预测肽的实际抑制效果，而新的策略则能够弥补这一缺陷。此外，研究还强调了色氨酸在XO抑制中的重要性，表明含有色氨酸的肽可能具有更高的抑制潜力。这些发现不仅有助于开发新型的XO抑制剂，还为功能性食品和药物研究提供了新的方向。

在本研究中，作者们分别承担了不同的研究任务。Arshia Amjad负责撰写和修改论文、进行实验调查以及数据整理；Rongchao Wang参与了方法设计和实验调查；Li Zhao提供了研究的指导和支持；Lei Du参与了论文的撰写和修改，并提出了研究的构想；Jingli Xie则负责论文的撰写和修改，提供了研究的指导，并负责资金的获取和研究的构想。这种分工合作的方式确保了研究的顺利进行，并提高了研究结果的科学性和可靠性。

本研究的成果得到了中国国家关键研发计划的支持，项目编号为2020YFA0907800。这一支持不仅体现了研究的重要性，也为进一步的研究提供了必要的资源。研究团队在本研究中所采用的综合筛选策略，为未来探索其他类型的生物活性肽提供了可借鉴的范例。通过结合多种评估指标，研究者能够更全面地了解肽与酶之间的相互作用，从而提高筛选的准确性和效率。

总体而言，本研究通过整合多种生物信息学和实验方法，成功开发了一种高效、准确的XO抑制肽筛选策略。这一策略不仅能够克服传统方法的局限性，还能够揭示肽与XO结合的分子机制，为开发新型药物和功能性食品提供了理论依据和技术支持。此外，研究还强调了色氨酸在XO抑制中的关键作用，表明含有色氨酸的肽可能具有更高的抑制潜力。这些发现对于治疗高尿酸血症和痛风等疾病具有重要的现实意义。