利用超高性能液相色谱-串联质谱技术同时测定全血和尿液中的19种乌头碱

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Simultaneous determination of 19 Aconitum alkaloids in whole blood and urine by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

本研究建立了高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定人血和尿液中19种Aconitum生物碱的快速灵敏方法，并验证其可靠性。该方法利用Oasis PRIME MCX μElution固相萃取板实现高效富集和基质效应抑制，线性范围广（R2>0.99），精密度和准确性均符合药典标准（RSDs<9.1%，误差±9%）。稳定性实验表明，苯甲酰化生物碱室温下8小时内显著降解，而其他生物碱在冻融循环和长期冷冻下稳定性良好。应用25例急性生物碱中毒死亡病例证实，尿液中生物碱浓度普遍高于血液，且存在个体差异显著的特征。特别发现一起仅含低毒非酯类生物碱而无高毒二酯类生物碱的独特中毒案例，提示需扩展检测谱。研究强调单一化学组学不足以鉴定Aconitum物种，需结合多学科策略以提升毒理学诊断准确性。

　　本研究提出了一种快速且高灵敏度的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，用于同时检测人体血液和尿液中的十九种乌头属（*Aconitum*）生物碱。该方法的建立和验证对于临床和法医学领域中乌头属中毒的分析具有重要意义。乌头属植物广泛分布于全球，其中中国拥有超过200种本土物种，许多被用于传统医学。然而，这些植物含有强效的二萜类生物碱，具有狭窄的治疗窗口和显著的毒性，可能导致急性中毒，表现为严重的心脏毒性，如心律失常和低血压，甚至致命。

由于乌头属植物的生物碱种类繁多，且不同物种之间存在显著的化学组成差异，单一的检测方法难以满足全面的毒理学分析需求。因此，本研究的目标是开发一种能够覆盖多种关键生物碱的分析方法，包括具有代表性的二酯型（DDAs）、一酯型（MDAs）以及醇胺型（非酯型）二萜类生物碱。通过这一方法，研究人员希望提高对乌头属中毒的诊断准确性和法医学评估的可靠性。

在方法开发过程中，研究人员采用了Oasis PRIME MCX μElution板进行样品前处理，这是一种新型的固相萃取（SPE）技术，能够高效提取生物碱并减少基质效应。该方法相比传统的蛋白沉淀（PPT）或使用其他SPE材料的方法，具有更高的选择性和灵敏度。此外，通过优化UPLC-MS/MS的条件，研究人员实现了对多种生物碱的高通量检测。方法的验证结果显示，该技术在选择性、线性（R2 > 0.99）、精密度（RSDs < 9.1%）和准确度（±9%）方面表现优异，能够满足监管生物分析的指导原则。

值得注意的是，研究还发现，某些生物碱在室温下储存8小时内会发生显著降解，这可能与水解反应有关。因此，为了确保检测结果的可靠性，研究人员建议尽快进行分析，避免因样品降解而导致的误判。另一方面，其他类型的生物碱在冻融循环和长期冷冻储存条件下表现出不同程度的稳定性，这为样品保存提供了参考依据。在自动进样器中，样品在4°C下保存24小时后仍能保持较好的稳定性，进一步验证了该方法在实际应用中的可行性。

在实际应用中，研究人员将该方法应用于25例致命的乌头属中毒病例，结果表明，不同个体之间的生物碱浓度存在显著差异，且尿液中检测到的生物碱浓度通常高于血液。这提示尿液可能是更敏感的检测矩阵，尤其适用于中毒暴露的确认。此外，研究还发现了一起独特的集体中毒事件，其中仅检测到醇胺型生物碱，而未发现高度毒性的二酯型二萜类生物碱。这一发现表明，当前的毒理学调查中，需要进一步扩展检测的生物碱种类，以确保全面覆盖潜在的中毒成分。

乌头属植物的生物碱不仅在结构上存在多样性，而且其毒性表现也因种类而异。例如，二酯型生物碱如乌头碱、中乌头碱和次乌头碱因其独特的8-乙酰基-14-苯甲酰二酯基团而被认为是中毒中最常见的有毒成分。这些生物碱的检测对于判断中毒的严重程度和来源至关重要。而一酯型生物碱如苯甲酰乌头碱、苯甲酰中乌头碱和苯甲酰次乌头碱则在天然状态下存在，并且可能在传统加工过程中形成，因此也应纳入毒理学和质量控制的分析范围。近年来，研究还发现了一些含有8-乙酰基-14-茴香酰基团的新型二酯型生物碱，如云南乌头碱、粗叶乌头碱和前乌头碱，进一步扩展了乌头属中毒的生物碱谱系。

尽管醇胺型生物碱如前乌头碱、乌头碱B和塔拉辛碱通常被认为毒性较低，但它们在中毒案例中的出现表明，可能在某些情况下起到辅助或协同作用。因此，全面检测包括二酯型、一酯型和醇胺型生物碱对于准确评估中毒风险和提供可靠的诊断依据至关重要。研究中提到的这些生物碱在不同乌头属植物中普遍存在，其毒性效应可能因植物种类、摄入剂量、个体代谢能力等因素而有所不同。

在实际应用中，该方法的检测能力得到了验证，能够有效识别不同生物碱在血液和尿液中的分布情况。例如，在25例中毒案例中，研究人员发现尿液中的生物碱浓度普遍高于血液，这可能与生物碱在体内的代谢和排泄路径有关。此外，该方法在检测某些罕见但高毒性的生物碱方面也表现出色，如云南乌头碱和粗叶乌头碱。这些发现不仅有助于理解乌头属中毒的复杂性，也为法医学和临床毒理学提供了新的研究方向。

当前，乌头属生物碱的检测方法主要包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）、高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。GC-MS方法通常需要对样品进行衍生化处理，并且主要针对少数主要的二酯型生物碱。相比之下，HPLC方法在复杂生物基质中面临灵敏度和分辨率方面的挑战。而LC-MS/MS方法则显著提高了检测的灵敏度和特异性，能够同时检测多种生物碱。然而，尽管已有多种LC-MS/MS方法被开发，仍然存在一些局限性，如检测范围有限、验证数据不足等。

本研究中采用的Oasis PRIME MCX μElution板是一种创新的固相萃取技术，能够简化样品前处理流程，提高检测效率。通过直接加载和洗脱样品，无需进行复杂的条件调整，从而减少了实验时间和样品损失。此外，该技术还能够有效去除基质中的干扰物质，提高检测的准确性。研究人员通过系统评估不同的样品前处理方法，最终选择了该技术作为最佳方案。

在方法验证过程中，研究人员对检测的稳定性进行了详细研究。结果显示，某些生物碱在室温下储存8小时后会发生明显降解，这可能会影响检测结果的准确性。因此，研究人员建议在检测前尽快处理样品，以避免因降解导致的误判。同时，其他类型的生物碱在冻融循环和长期冷冻储存条件下表现出较好的稳定性，这为样品的长期保存提供了依据。此外，样品在自动进样器中保存24小时后仍能保持较高的稳定性，进一步证明了该方法在实际应用中的可靠性。

本研究的成果不仅为乌头属中毒的检测提供了新的技术手段，也为法医学和临床毒理学领域的研究提供了重要的参考。通过同时检测多种生物碱，该方法能够更全面地反映中毒情况，有助于准确判断中毒的来源和严重程度。此外，该方法的高灵敏度和高通量特性使其适用于大规模的毒理学筛查和研究，能够提高检测效率并降低实验成本。

在实际应用中，该方法的成功实施表明，乌头属中毒的诊断和评估需要依赖于综合性的分析策略。由于不同乌头属植物的生物碱组成和毒性可能存在差异，因此仅依赖于化学分析可能无法得出准确的结论。因此，研究人员建议采用多学科整合的方法，结合化学分析、毒理学评估和临床数据，以提高诊断的准确性和可靠性。

本研究的结论强调了建立全面的生物碱检测方法的重要性。通过同时检测二酯型、一酯型和醇胺型生物碱，该方法能够更有效地覆盖乌头属中毒的潜在成分，为中毒的快速诊断和法医学分析提供支持。此外，该方法的验证结果表明，其在临床相关浓度范围内具有良好的可靠性、精密度和准确度，能够满足实际应用的需求。因此，该方法有望成为乌头属中毒分析的标准化工具，为相关领域的研究和实践提供新的思路和方向。