基于单克隆抗体的SPCE逻辑回归模型的开发，用于预测接种A型口蹄疫病毒疫苗的动物的保护状态

《Journal of Virological Methods》：Development of monoclonal antibody based SPCE logistic regression model to predict the protective status of animals vaccinated against FMD virus type A

口蹄疫疫苗效价评估采用血清学间接方法替代传统活体挑战实验，通过87份犊牛血清样本的病毒中和试验（VNT）和两种单克隆抗体（2C4G11、6E8D11）基于SPCEs的检测，建立逻辑回归模型分析血清滴定与保护率的关系，确定不同检测方法的保护阈值（VNT>1.204，pAb>1.041，mAb 2C4G11和6E8D11均>1.204），并验证单克隆抗体SPCEs的高效性和动物福利优势。

　　本研究聚焦于印度等流行地区中，如何有效评估口蹄疫（Foot-and-mouth disease, FMD）疫苗的效力。FMD是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的一种跨国界的、需要报告的传染病，对畜牧业和社会经济造成严重影响。FMDV是一种包膜病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridae），早在1950年代就被发现为首个动物病毒。该病的主要特征包括高热、严重的口腔溃疡（如舌、牙龈、趾间、乳房和鼻部），成年牛体重减轻，幼牛生长减缓等。FMD的后果如乳房炎、呼吸急促、流产、不孕、耐旱能力下降以及产奶量减少，均对农民造成严重的经济损失。此外，由于FMD的传播性，对动物及其制品的出口也受到严格限制，仅限于FMD无疫国家。

在印度，FMD主要由O、A和Asia1三个血清型引起，其爆发比例分别为92.7%、3.6%和1.8%。为了控制这种疾病，印度政府推行了全国性的动物疾病控制计划（National Animal Disease Control Programme, NADCP），后来更名为“畜牧业健康与动物疾病控制计划”（Livestock Health and Animal Disease Control Programme, LHDCP），旨在通过大规模接种疫苗和严格的生物安全措施来减少FMD的传播。目前，印度使用的FMD三价灭活疫苗包括三种FMDV毒株：O/IND/R2/1975、A/IND/40/2000和Asia1/IND/63/1972。这些疫苗的效力评估是确保其质量的重要环节。

传统的FMD疫苗效力评估方法主要依赖于活体挑战试验，如PD50（保护剂量50）或PGP（对广泛性蹄部感染的保护）试验。这些方法需要将动物接种疫苗后，再用活病毒进行挑战，观察其是否出现继发性病变，如蹄部病变等。然而，这种方法存在诸多问题。首先，活体挑战试验对动物的健康状况产生显著影响，导致动物福利和伦理问题。其次，由于挑战过程中可能会有病毒逃逸到外部环境，因此需要极为严格的生物安全措施，以防止FMD的进一步传播。此外，每个疫苗批次只能使用一种血清型的病毒进行挑战，限制了测试的灵活性。同时，由于样本量较小（通常每个批次仅使用16头动物），统计分析的准确性受到影响。最后，这种方法耗时较长，难以满足大量疫苗批次的快速评估需求。

鉴于上述问题，研究者提出了一种替代的血清学方法，用于预测动物的保护状态，从而替代传统的活体挑战试验。这种方法基于血清学指标，如疫苗接种后28天的血清滴度（log?? serum titre, ti），与动物实际接种疫苗后的保护结果（protection probability, pi）之间的关系。通过构建逻辑回归模型，研究者能够更准确地预测疫苗的效力，同时减少对活体动物的依赖，提高实验效率和动物福利。

在本研究中，使用了87份来自疫苗接种28天后的犊牛血清样本，通过病毒中和试验（Virus Neutralization Test, VNT）和固相竞争酶联免疫吸附测定（Solid Phase Competition Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, SPCE）进行分析。VNT需要依赖细胞培养，而SPCE则利用多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）或单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）来检测抗体水平。研究者选择了两种单克隆抗体，即mAb 2C4G11和mAb 6E8D11，用于SPCE测试。这些抗体能够特异性地识别FMD病毒的结构蛋白，从而提高检测的准确性。

研究中构建了四个logit模型，并通过ROC分析确定了不同保护概率（如50%、75%和95%）对应的ti阈值。结果显示，VNT和mAb SPCE均呈现出S型logit曲线，表明ti与pi之间存在显著的正相关关系。在比较不同模型的拟合效果时，基于AIC（Akaike Information Criterion）和Somers’ D指标，mAb 2C4G11 SPCE被确定为最佳拟合模型。然而，mAb 6E8D11 SPCE在75%保护概率下的ti阈值表现出更高的准确性。这表明，这两种单克隆抗体的SPCE方法在预测同源保护方面具有潜力。

研究者进一步探讨了这些血清学方法的优势。相比传统的活体挑战试验，血清学方法能够覆盖动物之间的生物学差异，提高预测的准确性。此外，使用单克隆抗体的SPCE方法可以减少多克隆抗体带来的纯度不均、产量低以及重复优化的问题，从而提高实验的可重复性和效率。这种方法还符合动物福利的“4R”原则，即“替代、减少、优化和责任”，通过使用统计模型替代活体动物试验，减少了对动物的依赖，同时提高了研究的伦理标准。

在实验过程中，研究者使用了BHK-21细胞系进行VNT。这些细胞在含10%胎牛血清的GMEM培养基中培养，并在接种FMDV A/IND/40/2000毒株后进行观察。当细胞出现完全的细胞病变后，病毒被收获、澄清、滴定并用于VNT。为了确保检测的准确性，病毒被灭活（使用二乙烯基乙胺），冻干后用于后续的实验。此外，研究者还探讨了不同血清学方法的重复性，包括同一天和不同天的检测结果，以确保实验数据的可靠性。

研究结果表明，疫苗接种后的血清滴度与实际接种后的保护结果之间存在良好的统计关系。通过分析这些数据，研究者能够确定不同保护概率对应的ti阈值，从而为疫苗效力的评估提供依据。在实际应用中，这些血清学方法可以作为疫苗效力评估的替代工具，减少对活体动物的依赖，提高评估效率，同时确保动物福利。此外，这种方法还可以用于大规模疫苗批次的快速评估，为疫苗的生产和使用提供科学支持。

本研究的创新点在于，通过建立逻辑回归模型，将血清学指标与疫苗效力预测结合起来。这种方法不仅提高了疫苗效力评估的准确性，还减少了实验成本和时间。此外，研究者还探讨了不同血清学方法的适用性，如VNT、pAb SPCE和mAb SPCE，并比较了它们在预测保护状态方面的效果。结果显示，mAb SPCE在预测保护状态方面具有更高的准确性，特别是在75%保护概率下，其ti阈值与其他方法相比更为稳定。

在实际应用中，这些血清学方法可以用于疫苗的生产和质量控制，帮助疫苗制造商确保疫苗的有效性。此外，这些方法还可以用于兽医机构和动物疫病监测部门的日常工作中，为FMD的防控提供科学依据。通过这些方法，可以更有效地监测疫苗接种效果，及时发现和处理潜在问题，从而减少FMD的传播风险。

总之，本研究通过建立基于逻辑回归的模型，探索了血清学方法在预测FMD疫苗效力方面的潜力。这种方法不仅提高了疫苗效力评估的准确性，还减少了对活体动物的依赖，符合动物福利的“4R”原则。此外，这种方法可以用于大规模疫苗批次的快速评估，为疫苗的生产和使用提供科学支持。未来，研究者建议通过更大规模的样本进行进一步验证，以确保这些方法的广泛适用性和可靠性。