非侵入性的定量声学成像技术用于完整脑类器官的结构评估，以辅助药物发现过程

《Materials Today Advances》：Non-invasive quantitative acoustic imaging of intact brain organoids for structural assessment in drug discovery

定量表征人脑类器官的微观结构变异对神经科学基础研究和转化应用（如药物开发）至关重要。本研究通过整合高频超声声显微镜（SAM）与统计模型分析，开发了一种非侵入式、定量评估脑类器官机械特性与组织异质性的方法。采用40 MHz和60 MHz换能器对类器官进行三维成像，通过有限元素模拟验证换能器性能，发现60 MHz换能器在保持适度穿透深度的同时提供更高空间分辨率。利用Rayleigh和Nakagami分布分析散射振幅，发现Nakagami模型（形状参数m=0.62-0.94）能更精准地捕捉类器官中神经增殖区（m接近1）与分化区（m降低）的散射异质性，其定量参数与免疫荧光标记的神经干细胞分布（SOX2+）和神经元成熟度（MAP2+、TUBB3+）高度相关。该方法为类器官标准化和药物筛选提供新工具，可检测早期病理改变（如β-淀粉样蛋白沉积）并实现纵向监测。

　　在人类脑类器官（brain organoids）的研究中，理解其微观结构的变化对于推进基础神经科学和转化应用至关重要，例如药物开发和研究组织发育与病理。本文中，研究者采用高频扫描声学显微镜（Scanning Acoustic Microscopy, SAM）对完整的脑类器官进行了成像，并结合实验和数值模拟对使用的40 MHz和60 MHz换能器进行了性能评估，以确认其适用于高分辨率声学成像的可行性。通过分析回波幅度的统计分布，利用瑞利（Rayleigh）和纳卡米（Nakagami）模型来推断组织的异质性，这一方法能够捕捉到常规B模式图像无法显示的细微结构差异。研究发现，在所有感兴趣区域（ROIs）中，纳卡米分布的形状参数m范围从0.62到0.99，分别对应于均匀的神经增殖区和异质性的分化区域，表明该方法能够有效区分发育的不同区域。这些发现表明，结合换能器性能验证的统计声学成像为无创且定量地研究脑类器官的结构提供了一种新方法，从而促进了药物开发和组织生长与疾病进展研究的深入。

在神经科学研究中，脑类器官作为一种体外模型，能够模仿大脑的复杂组织结构和发育过程。然而，传统的研究方法如光学显微镜、CT扫描和MRI等在获取生物机械特性（如弹性或声阻抗）方面存在局限性。光学显微镜虽然能够提供高分辨率的图像，但其穿透深度有限，无法有效评估生物组织的弹性特性，而CT和MRI则在软组织成像方面表现优异，但缺乏足够的分辨率来分析细胞和亚细胞层面的结构。因此，开发一种能够提供高分辨率且具有足够穿透深度的成像技术对于深入理解脑类器官的机械和结构特性具有重要意义。

扫描声学显微镜（SAM）作为一种非侵入性、非破坏性的成像技术，已在材料科学和生物学领域得到了广泛应用。SAM能够准确地表征样品的厚度、声速、表面和亚表面缺陷以及机械特性如杨氏模量等。在生物医学领域，SAM被广泛用于评估生物和仿生组织，特别是高频率声学成像（高于25 MHz）能够提供更丰富的组织信息。随着高频率超声波在生命科学中的广泛应用，其在生物医学成像和组织表征中的贡献不断增长。作为一种非侵入、非破坏且穿透力强的技术，SAM显著增强了仿生材料和生物样本的声学成像能力，从而为材料科学和生物医学应用提供了关键的洞察。

在本研究中，研究者首先对40 MHz和60 MHz的换能器进行了实验和数值模拟的双重验证。实验过程中，研究团队利用COMSOL Multiphysics 5.6软件进行有限元模拟，以评估换能器的聚焦能力和声学场特性。通过这些模拟，研究者获得了换能器在不同频率下的聚焦特性，如轴向压力分布和横向压力分布。结果显示，40 MHz换能器在轴向和横向分辨率之间达到了较好的平衡，而60 MHz换能器则提供了更高的横向分辨率，但其穿透深度略低于40 MHz换能器。这些换能器的性能验证为后续的脑类器官成像提供了重要的理论支持。

在脑类器官的制备过程中，研究团队采用了改进的诱导多能干细胞（iPSCs）方法。人类iPSCs KISCOi001-A被分化为皮层类器官，随后在Matrigel中培养，并通过旋转生物反应器进一步促进营养物质的分布和组织的成熟。这一过程最终形成了具有复杂三维结构的成熟脑类器官，为后续的声学成像提供了良好的材料基础。为了确保成像过程中的稳定性，研究者将脑类器官嵌入到一个1 wt%的琼脂糖凝胶基质中，以减少样品在成像过程中的位移和外部干扰。

在声学成像过程中，研究团队设计了一种自定义的超声波扫描系统，该系统结合了Leica DMi8倒置显微镜和高精度的ASi MS-2000 XYZ扫描台，以实现高分辨率的成像。LabVIEW软件被用来控制扫描台和其他显微镜组件，而National Instruments的PXIe FPGA模块和FlexRIO硬件则用于实现超声波功能。整个系统能够在特定的扫描区域（1.75 mm × 1.75 mm）内获取高分辨率的图像，每个像素代表12.5 μm的大小。通过使用40 MHz和60 MHz的PVDF聚焦换能器，研究团队能够对脑类器官的结构和生物机械特性进行多尺度的分析。

在分析声学数据时，研究者采用了瑞利和纳卡米分布模型来拟合回波幅度的概率分布。瑞利分布适用于均匀的散射环境，其中散射体随机分布且数量众多，而纳卡米分布则引入了形状参数m，能够更好地描述复杂和异质的散射行为。研究者通过实验数据和模拟结果发现，纳卡米分布能够更准确地拟合实验数据，尤其在异质性较高的区域中，其形状参数m能够反映出组织的微观结构差异。通过多次重复实验和随机的ROI采样策略，研究团队确保了参数估计的稳健性和统计可靠性，同时也减少了局部异质性对结果的影响。

在实验结果中，研究团队展示了不同ROI区域的回波幅度分布情况，并通过瑞利和纳卡米模型进行拟合。结果显示，纳卡米模型在大多数情况下能够更准确地描述回波幅度分布，而瑞利模型则在均匀区域中表现良好。通过分析不同ROI的参数，研究者能够区分脑类器官中不同发育阶段的区域，如均匀的神经增殖区和异质的分化区。此外，研究者还探讨了声学参数与免疫荧光成像之间的相关性，以验证SAM对脑类器官微观结构变化的敏感性。

研究团队还评估了不同频率换能器在成像深度和分辨率方面的性能差异。40 MHz换能器的成像深度可达1.2–1.5 mm，而60 MHz换能器则受限于0.9–1.1 mm的深度范围。尽管如此，这些换能器的成像能力仍然足以覆盖大多数用于药物筛选的脑类器官（通常直径在0.5–2.0 mm之间）。对于直径超过2.0 mm的脑类器官，研究者建议采用多角度成像或结合低频换能器进行初步评估，再使用高频换能器进行特定区域的详细分析，或者利用计算方法校正深度依赖的衰减。这种灵活的成像策略能够确保在不同尺寸和发育阶段的脑类器官中都能获得高质量的声学数据。

在药物筛选的应用中，SAM不仅能够用于标准化脑类器官的质量，还能够提供实时的药物效果评估。通过SAM扫描生成的异质性图谱，研究人员可以筛选出具有相似发育特征的脑类器官，从而减少后续实验中的基线差异。一旦选定统一的脑类器官群体，候选药物可以在一致的培养条件下进行处理，随后的SAM成像能够量化药物对声学参数分布的影响。例如，一种有效的神经增殖区抑制剂可能会在原本具有较高m值的区域中引起显著的m值下降，而神经保护剂则可能在成熟区域中维持较高的m值。此外，神经毒性药物可能会导致m值的异常降低，这可能对应于细胞损伤和组织紊乱的区域。这种非侵入性的声学表征方法能够为药物筛选提供客观的指标，减少对破坏性组织学分析的依赖。

然而，本研究也存在一些局限性。首先，高频超声波的穿透深度有限，这限制了对直径超过2 mm的脑类器官的全面分析。其次，研究仅涉及两个脑类器官（OR1和OR2），这可能影响统计分析的稳健性。未来的研究应包括更多样本（n > 5）来自多个独立批次，以评估声学参数的稳定性及其在不同发育阶段中的可重复性。此外，虽然研究团队通过免疫荧光成像验证了声学参数与组织结构之间的关系，但并未实现声学扫描与组织切片之间的精确空间配准。未来的工作可以引入共注册成像技术，以更深入地理解结构与功能之间的关系。同时，当前的成像系统需要将脑类器官固定在琼脂糖凝胶基质中，这可能引入机械应力并限制长期监测。设计可灌注的成像装置将有助于在生理条件下进行真实的纵向研究。最后，尽管系统能够提供58–80 μm的横向分辨率，但其仍无法分辨单个细胞，这限制了其在单细胞动态研究中的应用。因此，未来的研究应进一步优化成像技术，以提高分辨率和穿透深度，从而更全面地研究脑类器官的结构和功能。

总的来说，本研究展示了统计建模在回波超声信号分析中的有效性，用于表征人类脑类器官的微观结构特性。通过实验和数值模拟验证换能器的性能，并结合瑞利和纳卡米分布模型，研究者能够准确地评估组织的散射特性，从而为药物筛选和疾病建模提供新的工具。未来的工作应进一步扩展研究范围，包括更多的脑类器官样本和不同发育阶段的分析，以提高方法的稳健性和可重复性。此外，通过结合多模态成像技术，如光学清除和三维共聚焦显微镜，可以进一步验证声学参数与组织结构之间的关系，为非侵入性、定量的组织表征提供更全面的解决方案。