针对非小细胞肺癌中由趋化因子驱动的转移：趋化因子纳米海绵的研制与治疗评估

《Materials Today Bio》：Targeting chemokine-driven metastasis in non-small cell lung cancer: Development and evaluation of chemokine nanosponges for therapy

非小细胞肺癌（NSCLC）转移与M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）分泌的CCL20密切相关。本研究通过单细胞RNA测序发现M2 TAMs显著分泌CCL20，并设计了一种基于CCR6靶向的纳米海绵（CCR6-MM@PS/R848），通过吸附CCL20并负载免疫激活剂R848，实现肿瘤精准靶向治疗。实验证实该纳米海绵可抑制肿瘤生长和转移，同时促进M2 TAMs向M1型极化，降低CCL20分泌。摘要：

　　非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常见的类型之一，其预后较差且转移率较高。转移过程涉及复杂的生物学机制，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）分泌趋化因子是一个重要的环节。在本研究中，我们利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术发现，在转移性病灶中，M2型TAMs的趋化因子分泌功能显著增强，其中CCL20被鉴定为关键的靶点。基于这一发现，我们设计了一种能够吸附CCL20的纳米海绵（CCR6-MM@PS/R848），通过工程化高表达CCR6的巨噬细胞并提取其膜结构来构建该纳米海绵。这种纳米海绵结合了巨噬细胞膜的靶向能力和趋化因子吸附功能，为高CCL20肿瘤提供了精准治疗的可能。此外，我们还利用巨噬细胞膜作为载体，封装Toll样受体7/8激动剂R848，以诱导M2型巨噬细胞向M1表型极化，从而减少CCL20的分泌，并将免疫抑制的肿瘤微环境（TME）转化为免疫原性环境。通过体外和体内实验验证了CCR6-MM@PS/R848的治疗潜力，展示了其生物相容性、巨噬细胞极化效果以及对肿瘤生长和转移的双重抑制作用。我们的研究结果表明，趋化因子纳米海绵在NSCLC转移治疗中具有广阔的前景。

肺癌作为一种常见的恶性肿瘤，其治疗和预后一直是医学研究的重点。NSCLC占据了肺癌病例的约85%，但即使在诊断和治疗方面取得了显著进展，患者的总体预后仍然不理想，5年生存率仅在15%到30%之间。肿瘤转移是导致治疗失败和高死亡率的主要原因之一，且大约三分之一的NSCLC患者在初始诊断时就已经存在转移。NSCLC的转移过程包括多种机制，如肿瘤细胞的侵袭、新血管生成（angiogenesis）以及免疫逃逸。近年来，研究者们发现了多个与NSCLC转移潜力相关的分子通路、解剖特征和遗传特征，包括缺氧诱导的上皮-间质转化（EMT）、通过PD-1/PD-L1通路的免疫逃逸，以及特定基因突变如EGFR和KRAS的作用。其中，趋化因子的分泌被认为是NSCLC转移过程中的一个重要因素。

趋化因子是一类小分子信号蛋白，它们在调控免疫细胞募集和肿瘤进展中发挥关键作用。例如，趋化因子CCL2已被证实能够通过招募巨噬细胞和其他免疫细胞促进肿瘤生长和转移。TAMs在肿瘤微环境中起着至关重要的调控作用，它们可以极化为M1型巨噬细胞（iNOS+CD80+），这类细胞产生IL-12和TNF-α以抑制肿瘤生长；也可以极化为M2型巨噬细胞（Arg-1+CD206+），这类细胞分泌IL-10、CCL20等细胞因子，从而推动肿瘤进展和转移。尽管已有大量研究揭示了趋化因子与肿瘤转移之间的关系，但目前对趋化因子在肿瘤转移中的具体作用机制和调控途径仍存在诸多未知。肿瘤异质性是研究中的主要挑战之一，使得建立趋化因子表达与转移潜力之间的明确关联变得困难。此外，趋化因子在TME中的来源和调控机制仍未完全阐明。

随着纳米生物技术的发展，细胞膜工程已成为一种新兴的治疗方法。细胞膜，尤其是巨噬细胞膜，具有固有的靶向能力和良好的生物相容性，使其成为将治疗药物直接递送至肿瘤部位的理想载体。通过工程化巨噬细胞膜以表达特定的受体或配体，可以增强其对肿瘤的靶向性和对TME的调控能力。例如，表达趋化因子受体如CCR2的巨噬细胞膜已被证明在肿瘤药物递送中具有潜在的应用价值。此外，细胞膜包覆的纳米颗粒（CNPs）也已被开发出来，以提高药物递送效率。这些CNPs结合了巨噬细胞膜的靶向能力与合成纳米颗粒的药物携带能力，为癌症治疗提供了一个多功能平台。

基于上述背景，我们设计了一种能够吸附趋化因子CCL20的纳米海绵（CCR6-MM@PS/R848）。该纳米海绵利用CCL20与CCR6之间的配体-受体相互作用，通过工程化高表达CCR6的巨噬细胞并提取其膜结构来构建。这种纳米海绵不仅具有巨噬细胞膜的靶向能力，还具备趋化因子吸附功能，使其能够精准地治疗高CCL20水平的肿瘤。此外，我们还利用巨噬细胞膜作为载体，封装Toll样受体7/8激动剂R848，以诱导M2型巨噬细胞向M1表型极化，从而减少CCL20的分泌，并将免疫抑制的TME转化为免疫原性环境。体外和体内实验验证了CCR6-MM@PS/R848的治疗潜力，展示了其生物相容性、巨噬细胞极化效果以及对肿瘤生长和转移的双重抑制作用。我们的研究结果表明，趋化因子纳米海绵在NSCLC转移治疗中具有广阔的前景。

在本研究中，我们首先通过scRNA-seq分析了NSCLC患者肺组织样本，包括原发性肿瘤和转移性病变。数据处理和分析采用Seurat R包，通过质量控制排除低质量数据，确保后续分析的可靠性。我们识别出13个不同的细胞簇，并基于其标志基因和基因表达谱进行了验证。总共有8种细胞类型被注释，包括T细胞（标志基因：CD3D、TRAC）、上皮细胞（标志基因：EPCAM、KRT19）、巨噬细胞（标志基因：CTSB、MARCO）、B细胞（标志基因：CD79A、IGHM）、自然杀伤细胞（NK细胞，标志基因：NKG7、GNLY）、成纤维细胞（标志基因：DCN、COL1A1）、肥大细胞（标志基因：MS5A2、GATA2）和内皮细胞（标志基因：PECAM1、RAMP2）。各细胞类型在不同样本和组别中的比例也进行了分析，结果显示T细胞、上皮细胞、巨噬细胞和B细胞的比例较高，而NK细胞、成纤维细胞、肥大细胞和内皮细胞的比例相对较低。比较分析发现，转移组与非转移组之间细胞比例存在显著变化，尤其是T细胞和B细胞的比例明显下降。这些发现表明，肺癌转移与免疫细胞重塑密切相关。免疫细胞比例的变化，特别是T细胞和B细胞的减少，凸显了TME在转移过程中的动态特性。这种免疫细胞的转变可能有助于免疫逃逸和肿瘤进展，强调了在治疗策略中靶向免疫细胞群体的重要性。

接下来，我们对巨噬细胞极化和CCL20表达进行了深入分析。巨噬细胞在NSCLC转移过程中起着关键作用，它们通过多种机制促进免疫逃逸和肿瘤转移，包括增强肿瘤细胞的侵袭和扩散。我们对巨噬细胞进行了子群分析，识别出经典型巨噬细胞（M1）和替代激活型巨噬细胞（M2），其中M1型巨噬细胞以IL1B和TNFAIP3等标志基因为特征，而M2型巨噬细胞则以CCL18和CD163为标志。对M2型巨噬细胞的差异分析显示，其基因表达显著上调，并通过GO和KEGG富集分析揭示了与细胞因子介导的信号传导和细胞因子活性相关的通路显著激活，表明细胞因子在转移性TME中具有广泛的调控作用。KEGG分析进一步确认了细胞因子-细胞因子受体通路的上调，进一步强调了细胞因子在转移中的关键作用。为了系统评估该通路中哪些细胞因子具有功能相关性，我们量化了所有在KEGG图谱中注释的11个基因的表达，并构建了相应的Kaplan-Meier生存曲线。其中，只有CCL20同时表现出显著更高的表达（log2FC=1.42，调整后p<0.001）以及与较差的总体生存率（HR=1.40，p=0.002）和无病生存率（HR=1.50，p=0.001）的强关联。其他细胞因子并未在两个标准中均达到统计学意义。这些数据确定了CCL20作为M2型巨噬细胞促进NSCLC转移的关键细胞因子候选者，并为靶向CCL20-CCR6轴的治疗策略提供了理论依据。

为了验证CCR6-MM@PS/R848的靶向能力，我们利用近红外荧光染料Cy5.5标记R848，并通过体外和体内实验追踪其分布和积累情况。在体外实验中，我们观察到CCR6-MM@PS/R848在LLC细胞中表现出显著更强的红色荧光，而在RAW264.7巨噬细胞中则显示出明显的增强的摄取，这与巨噬细胞膜的固有归巢特性一致。正常成纤维细胞（L929）在所有条件下均未表现出荧光信号，这表明该复合物对健康细胞具有较低的非靶向摄取。这一选择性靶向能力表明，该复合物能够有效将R848递送至肿瘤微环境，同时避免对正常组织的不良影响。体内实验中，我们通过荧光成像观察到CCR6-MM@PS/R848在肿瘤部位的荧光信号显著强于PS/R848组。器官取出后的荧光成像进一步证实了这一结果，显示在肝、肾和脾等器官中，CCR6-MM@PS/R848组的信号强度显著高于PS/R848组。这些结果表明，CCR6-MM@PS/R848具有良好的靶向肿瘤的能力，能够有效地将药物递送至特定部位，从而提高治疗效果并减少全身毒性。

此外，我们对CCR6-MM@PS/R848的生物相容性进行了评估。在体外实验中，我们通过活/死染色和CCK-8实验评估了该复合物对L929细胞的毒性，结果显示各治疗组之间细胞存活率无显著差异，表明CCR6-MM@PS/R848对正常细胞无显著毒性。在体内实验中，我们对主要器官（心、肝、脾、肺、肾）进行了组织病理学检查，并未发现组织损伤或炎症的迹象，进一步支持了该复合物的生物相容性。这些结果表明，CCR6-MM@PS/R848在体外和体内均表现出良好的生物相容性，为未来的临床应用提供了基础。

在体内实验中，我们进一步验证了CCR6-MM@PS/R848对M2型巨噬细胞向M1型极化的促进作用。免疫组化结果显示，CCR6-MM@PS/R848组的Arg-1阳性率显著降低，而iNOS阳性率明显升高，表明该复合物能够有效地将巨噬细胞从M2型转化为M1型。这一转变对于增强抗肿瘤免疫反应至关重要，因为M1型巨噬细胞具有促炎性和抗肿瘤特性。流式细胞术分析进一步验证了这一极化效果，结果显示CCR6-MM@PS/R848组中F4/80和CD206双阳性细胞的比例显著减少，而F4/80和CD86双阳性细胞的比例显著增加，这表明该复合物能够有效地将TAMs从M2型极化为M1型。Western blot分析和q-PCR结果也与这些发现一致，进一步支持了CCR6-MM@PS/R848在蛋白和mRNA水平上的极化效应。这些结果表明，CCR6-MM@PS/R848在体内具有显著的极化能力，能够增强抗肿瘤免疫反应并克服TME中的免疫抑制。

为了进一步评估CCR6-MM@PS/R848对肺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用，我们进行了体外实验。ELISA分析显示，CCR6-MM@PS/R848显著降低了巨噬细胞培养液中的CCL20水平，这一效应归因于R848诱导的M2→M1极化和CCR6介导的CCL20残留吸附。Transwell迁移和侵袭实验的结果表明，使用CCR6-MM@PS/R848处理后的巨噬细胞培养液显著抑制了LLC细胞的迁移和侵袭能力。这表明，CCR6-MM@PS/R848通过调节TME中的CCL20水平，有效抑制了肺癌细胞的转移潜力。划痕实验进一步支持了这一结论，显示使用该处理后的巨噬细胞培养液显著减少了LLC细胞对划痕区域的迁移，表明其在抑制肿瘤转移方面具有重要作用。

在体内实验中，我们还评估了CCR6-MM@PS/R848对肺癌转移的抑制效果。首先，我们确定LLC细胞是否适合作为高CCL20肿瘤模型，通过比较五种小鼠肿瘤细胞系（MC38、CT26、4T1、B16-F10、Panc02）的CCL20分泌量，发现LLC细胞分泌的CCL20最多，验证了其作为高CCL20模型的适用性。随后，我们通过尾静脉注射LLC-Luc细胞（1×10^6细胞/小鼠）建立了肺转移模型，并在肿瘤接种后7天开始治疗。将小鼠随机分为四组（n=10），分别接受生理盐水、PS/R848、MM@PS/R848或CCR6-MM@PS/R848的静脉注射，每周两次，共四次。记录小鼠体重作为全身毒性的替代指标，并监测生存情况直至达到人道终点。在第28天，我们对部分小鼠（n=5）进行处死，以统计肺部转移性结节的数量、进行组织病理学分析以及评估CCL20的表达情况。结果显示，各治疗组的小鼠体重变化无显著差异，表明CCR6-MM@PS/R848治疗未引起显著的全身毒性。生存曲线分析表明，CCR6-MM@PS/R848组的小鼠生存时间显著延长，表明该治疗有效抑制了肿瘤进展并改善了生存结果。肺部的外观和各治疗组中转移性结节数量的比较显示，CCR6-MM@PS/R848组的转移性结节数量显著减少，直观地展示了该治疗对肺转移的抑制效果。组织病理学检查进一步支持了这一发现，H&E染色显示，使用CCR6-MM@PS/R848治疗的小鼠肺部转移性病变显著减少。免疫组化结果显示，CCR6-MM@PS/R848组的CCL20阳性率显著降低，ELISA结果也显示该组的CCL20水平显著下降。为了进一步验证肿瘤细胞来源的CCL20在转移中的作用，我们生成了LLC-CCL20-KO细胞，并在平行实验中发现，接受LLC-CCL20-KO细胞的小鼠肺部转移性结节数量显著减少，相较于亲本LLC细胞对照组，这表明肿瘤来源的CCL20在转移过程中具有功能上的重要性。这些结果表明，CCR6-MM@PS/R848通过减少CCL20的分泌，有效抑制了肺癌的转移潜力。

综上所述，本研究通过一系列体外和体内实验，验证了CCR6-MM@PS/R848在抑制NSCLC转移方面的潜力。该复合物不仅能够有效减少CCL20的分泌，还能够通过R848诱导M2型巨噬细胞向M1型极化，从而将免疫抑制的TME转化为免疫原性环境。这些结果表明，CCR6-MM@PS/R848是一种具有双重“靶向与中和”作用的新型治疗策略，能够在不引起全身毒性的情况下有效抑制转移。此外，该复合物的模块化设计可以推广至其他由不同趋化因子轴驱动的恶性肿瘤，为精准免疫代谢治疗提供了通用的蓝图。通过将受体介导的配体捕获与局部免疫重编程相结合，本研究为协同、精准的癌症免疫治疗建立了一种新的范式，可以针对多种肿瘤适应症进行定制化应用。