利用咔唑平台实现次氯酸盐的集成荧光检测：细胞成像、环境监测及智能手机分析

《Microchemical Journal》：Integrated fluorescent sensing of hypochlorite using a carbazole platform: cellular imaging, environmental monitoring, and smartphone analysis

CRISPR增强荧光aptasensor结合滚环扩增技术实现万古霉素高灵敏检测，检测限达164 aM，线性范围1 fM-10 nM，显著提升治疗药物监测精准度与成本效益。

　　vancomycin是一种由链霉菌属产生的天然糖肽类抗生素，其复杂的分子结构使其在治疗耐药性细菌感染方面具有独特的作用。尤其是对于甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的感染，vancomycin被认为是重要的治疗药物之一。然而，vancomycin的治疗浓度范围较为狭窄，这使得其在临床应用中需要进行治疗药物监测（TDM），以确保患者获得最佳剂量，同时避免因过量使用导致的肾毒性等不良反应。目前，用于检测vancomycin的方法多种多样，包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）、化学发光法、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及荧光免疫层析分析（FICA）等。这些方法在各自的领域中具有一定的优势，但也存在诸多局限性，如设备成本高、操作复杂、检测时间长以及检测结果的重复性差等。因此，开发一种更经济、便捷且高灵敏度的检测方法，对于提高vancomycin的临床应用效率和安全性具有重要意义。

近年来，DNA适配体因其高特异性、可设计性强以及易于合成等优点，成为检测生物分子的一种重要工具。DNA适配体是通过体外筛选技术获得的单链DNA（ssDNA）分子，其筛选过程被称为系统进化配体富集（SELEX）。这一技术能够筛选出能够特异性识别目标分子的DNA片段，从而为构建高灵敏度的生物传感器提供基础。在2019年，Kevin W. Plaxco等人成功识别出一种能够特异性结合vancomycin的适配体，其解离常数（Kd）约为0.1 μM，且其二级结构为茎环结构。这一发现为后续研究提供了重要的理论依据和实验基础。

与此同时，CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）系统因其高效的基因编辑能力和广泛的应用前景，成为生物检测领域的重要工具。CRISPR系统通过CRISPR RNA（crRNA）引导的Cas蛋白（如Cas12a）对目标DNA进行切割，从而实现对特定分子的识别和放大。Cas12a是一种来源于V-A型CRISPR系统的内切酶，能够通过crRNA识别互补的DNA序列，并在结合后激活，对非目标单链DNA进行随机切割。这一特性使得Cas12a在构建荧光生物传感器方面具有独特的优势。基于此，许多研究者尝试将CRISPR系统与DNA适配体结合，开发出一系列新型的检测方法。

为了进一步提高检测灵敏度，研究者们还探索了多种信号放大策略，如链式杂交反应（HCR）和滚环扩增（RCA）。HCR是一种通过DNA链的连续杂交形成长链结构的反应，能够实现对目标分子的快速放大。而RCA则是一种在恒温条件下进行的DNA扩增技术，能够通过引物链的延伸产生大量的DNA产物，从而提高检测信号的强度。这两种方法的结合为构建高灵敏度、高特异性的生物传感器提供了可能。因此，研究者们尝试将RCA与CRISPR系统结合，开发出一种新型的CRISPR增强荧光（CEF）适配体传感器。

在该研究中，构建的CEF适配体传感器结合了CRISPR系统和RCA技术，以实现对vancomycin的高效检测。该传感器以vancomycin适配体作为识别元件，能够特异性结合目标分子。当目标分子存在时，适配体与vancomycin结合，导致其从DNA四面体结构中释放，从而启动RCA反应。RCA反应产生的DNA产物能够激活Cas12a，使其对非目标单链DNA进行切割，进而释放荧光信号。这种信号放大机制使得该传感器在检测低浓度的vancomycin时具有较高的灵敏度和准确性。

为了验证该传感器的构建过程，研究者们采用了聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术。PAGE结果表明，DNA四面体结构（TE）能够成功组装，并且在目标分子存在时，TE结构会发生变化，释放出适配体，从而启动RCA反应。此外，RCA模板（RT）的构建也得到了验证，其结构在不同条件下保持稳定，能够有效进行扩增反应。这些实验结果表明，该传感器的构建过程是可行的，并且能够实现对vancomycin的高效检测。

该研究中构建的CEF适配体传感器具有多个显著优势。首先，其检测灵敏度高，能够在1 fM到10 nM的浓度范围内实现线性响应，检测下限达到164 aM。这一灵敏度水平远高于传统的检测方法，能够满足临床对低浓度生物标志物的检测需求。其次，该传感器的检测过程简便，能够在短时间内完成，无需复杂的仪器设备或专业人员的操作，从而降低了检测成本和时间。此外，该传感器的检测结果具有良好的重复性和准确性，能够为临床治疗提供可靠的参考数据。

该传感器的应用前景广阔，尤其是在治疗药物监测（TDM）和临床诊断领域。随着精准医疗的发展，对药物浓度的实时监测成为提高治疗效果和安全性的重要手段。vancomycin作为一种重要的抗生素，其治疗浓度范围狭窄，使得TDM显得尤为重要。而该传感器的高灵敏度、低成本和简便操作，使其成为TDM的理想工具。此外，该传感器的构建方法具有良好的可扩展性，能够适用于不同类型的生物分子检测，为未来的生物传感技术发展提供了新的思路。

在实际应用中，该传感器可以用于检测患者血液中的vancomycin浓度，从而指导临床医生调整药物剂量。对于耐药性细菌感染的患者，vancomycin的剂量调整需要精确控制，以确保治疗效果并避免不良反应。该传感器的高灵敏度和准确性能够为临床医生提供可靠的检测数据，从而优化治疗方案。此外，该传感器的便携性和快速性也使其在基层医疗和现场检测中具有应用潜力，能够提高医疗资源的利用效率。

在构建该传感器的过程中，研究者们采用了多种实验手段，包括分子设计、DNA自组装、信号放大和荧光检测等。首先，通过设计特定的DNA序列，构建了能够特异性识别vancomycin的适配体。其次，通过DNA自组装技术，将适配体与辅助DNA链结合，形成稳定的DNA四面体结构。在目标分子存在时，适配体与vancomycin结合，导致四面体结构的改变，从而启动RCA反应。RCA反应产生的DNA产物能够激活Cas12a，使其对非目标单链DNA进行切割，释放荧光信号。这一过程通过信号放大机制，使得检测信号显著增强，从而实现对vancomycin的高灵敏度检测。

该传感器的构建过程不仅需要精确的分子设计，还需要对实验条件进行优化。例如，在DNA自组装过程中，需要控制反应条件，以确保四面体结构的稳定性和功能性。在RCA反应中，需要选择合适的引物链和酶，以实现高效的扩增。此外，在Cas12a的激活过程中，需要确保crRNA与目标DNA的特异性结合，以避免非特异性切割。这些实验条件的优化对于提高传感器的性能至关重要。

在实际应用中，该传感器需要经过严格的验证，以确保其在复杂样本中的稳定性和准确性。例如，在检测患者血液中的vancomycin时，需要考虑样本中的其他成分对检测结果的干扰。此外，还需要对传感器的检测限进行评估，以确保其能够检测到低浓度的vancomycin。这些验证过程对于确保传感器的临床应用价值具有重要意义。

综上所述，该研究开发的CRISPR增强荧光适配体传感器在vancomycin的检测方面具有显著优势。其高灵敏度、低成本和简便操作，使其成为治疗药物监测和临床诊断的理想工具。此外，该传感器的构建方法具有良好的可扩展性，能够适用于其他生物分子的检测。随着生物传感技术的不断发展，该传感器的应用前景将更加广阔，为临床医疗和科学研究提供新的技术支持。