利用一种新型的无标记溶剂基位移测定方法，在活细胞中对药物作用进行全蛋白质组范围的监测

《Molecular & Cellular Proteomics》：Proteome-wide Monitoring of Drug Action in Living Cells using a Novel Label-free Solvent-based Shift Assay

SPICE是一种基于溶剂诱导蛋白质沉淀的活细胞蛋白质组学方法，可检测药物与靶蛋白的相互作用及其下游效应，如代谢产物靶点、蛋白质-蛋白质相互作用变化和信号传导事件。与SIPP（细胞提取物）和CETSA（热变性与蛋白质稳定性）互补，SPICE能识别直接靶点及间接效应，并支持短时间处理下的稳定性与丰度变化解耦分析。

　　在药物发现和开发过程中，识别药物与细胞蛋白的相互作用对于理解药物作用机制和发现潜在的脱靶效应至关重要。为此，科学家们开发了一种新的方法，称为SPICE（Solvent Proteome Profiling In Cells），旨在通过溶剂诱导的蛋白沉淀（SIPP）技术，在活细胞中对药物与蛋白的相互作用进行分析。这种方法不仅能够检测药物与靶点的直接相互作用，还能揭示药物对蛋白稳定性、蛋白-蛋白相互作用以及下游信号传导的间接影响。

SPICE方法的核心在于利用溶剂对活细胞中蛋白的变性作用，通过观察药物处理前后蛋白的变性曲线来评估药物对蛋白稳定性的影响。与传统的细胞裂解方法不同，SPICE能够在细胞完整状态下进行分析，从而更真实地反映药物在体内环境中的行为。这种方法克服了大多数其他无标签靶点识别方法的局限性，即它们通常需要对药物或蛋白进行化学修饰，这可能会影响药物的活性或特异性，甚至导致结果偏差。SPICE则避免了这种问题，使得药物与蛋白的相互作用分析更加直接和可靠。

通过对比SPICE与CETSA（Cellular Thermal Shift Assay）的结果，研究者发现这两种方法在检测药物靶点和其下游效应方面具有互补性。CETSA主要依赖于温度变化来诱导蛋白变性，而SPICE则通过有机溶剂如AEA（acetone:ethanol:acetic acid, 50:50:0.1 (v/v)）实现这一目的。虽然两者在某些蛋白质的稳定性变化上存在重叠，但它们在蛋白质种类和变化模式上表现出显著的差异。这种互补性使得SPICE能够检测到CETSA无法识别的蛋白质，如药物代谢产物的靶点或蛋白-蛋白相互作用的变化，从而为药物作用机制的研究提供了更全面的视角。

SPICE方法不仅适用于药物靶点的识别，还能够检测药物对蛋白稳定性的调控。例如，在使用Ibrutinib（一种共价抑制剂）的实验中，SPICE成功识别了BTK以及多个其他蛋白激酶作为其靶点，同时检测到了药物对蛋白稳定性的影响。对于分子胶（molecular glue）如Cyclosporine A（CsA），SPICE不仅能够检测其直接靶点，还能够揭示其对下游蛋白稳定性的影响，如影响蛋白-蛋白相互作用或导致蛋白降解。这种能力使得SPICE在分析药物对蛋白稳定性的影响方面具有独特的优势，尤其适用于研究药物代谢产物的靶点以及药物诱导的蛋白-蛋白相互作用变化。

为了提高实验效率，研究者还开发了SPICE的压缩格式。该格式通过将相同变性曲线的样本合并为一个样本进行分析，从而减少了实验所需的时间和资源。这种压缩方法不仅保留了SPICE的高灵敏度，还使得大规模药物筛选成为可能。通过对比压缩格式下的SPICE与CETSA和PISA（Protein Induced by Solvent Aggregation）的结果，研究者发现，SPICE能够检测到更多的蛋白质变化，并且这些变化与药物的作用机制密切相关。这种压缩格式的应用，使得药物靶点识别和机制解析更加高效，同时为后续的深入研究提供了基础数据。

SPICE的实验流程包括细胞培养、药物处理、溶剂诱导的蛋白变性、细胞裂解、蛋白沉淀、以及基于LC-MS/MS的定量蛋白组学分析。在药物处理阶段，细胞在含有特定浓度药物的培养基中孵育一定时间，随后被暴露于不同浓度的溶剂中。经过离心处理后，可溶性蛋白被收集并进行定量分析。这种方法能够检测到药物对蛋白稳定性的影响，而无需对蛋白或药物进行化学修饰，从而保留了药物在细胞内的天然状态。

在实验分析中，研究者利用定量蛋白组学技术，如TMT（Tandem Mass Tag）和DIA（Data Independent Acquisition）来识别和量化药物处理前后蛋白的变化。通过计算相对强度和使用统计分析方法，如limma包进行显著性检验，研究者能够区分药物引起的稳定性变化和背景噪声。此外，通过功能富集分析，如DAVID数据库的使用，研究者能够将稳定性变化与特定的生物学过程或功能类别相关联，从而进一步理解药物的作用机制。

SPICE方法的优势在于其能够在活细胞中检测药物对蛋白稳定性的影响，而这种影响不仅限于直接靶点，还包括药物代谢产物和下游信号传导的变化。此外，SPICE能够检测到共价药物靶点，以及药物诱导的靶点不稳定或稳定化现象，即使这些靶点在药物处理过程中发生了降解。这种能力对于研究分子胶和异双功能降解物（PROTAC）尤为重要，因为这些药物的作用机制涉及对靶点的招募和降解。

通过实际应用，研究者发现SPICE能够有效地检测多种药物的靶点，包括非共价抑制剂、共价抑制剂和分子胶。例如，在使用MK-2206（一种靶向AKT1和AKT2的药物）的实验中，SPICE不仅检测到了直接靶点，还发现了与AKT抑制相关的下游效应，如溶酶体和内体蛋白的稳定性变化。对于SCIO-469（一种p38-MAP-激酶抑制剂），SPICE检测到了多个信号通路中蛋白的稳定性变化，包括MAPK信号通路、EGFR信号通路、TGF信号通路和NGF信号通路。这些结果表明，SPICE不仅能够识别药物的直接靶点，还能揭示其对细胞内多个生物过程的影响。

在研究药物对蛋白-蛋白相互作用的影响方面，SPICE同样表现出色。例如，使用Cyclosporine A（CsA）进行实验时，SPICE检测到了多种蛋白-蛋白相互作用的变化，包括PPIases（肽基脯氨酸异构酶）与calcineurin（钙调神经磷酸酶）的相互作用。这些结果与已知的CsA作用机制一致，即通过诱导未折叠蛋白反应（UPR）和整合应激反应（ISR）来影响细胞内的蛋白稳定性。

此外，SPICE还能够检测药物对蛋白降解的影响。通过将SPICE数据与全蛋白组分析结果进行对比，研究者能够区分药物引起的稳定性变化和蛋白丰度变化。这种区分对于理解药物的作用机制至关重要，尤其是在研究分子胶和异双功能降解物时，因为这些药物的作用不仅涉及对靶点的直接结合，还包括对靶点的招募和降解。通过归一化处理，SPICE能够更准确地反映药物对蛋白稳定性的影响，而不仅仅是蛋白丰度的变化。

综上所述，SPICE方法在药物靶点识别和作用机制解析方面展现出强大的潜力。它不仅能够在活细胞中检测药物对蛋白稳定性的调控，还能揭示药物对蛋白-蛋白相互作用和下游信号传导的影响。与CETSA和PISA等方法相比，SPICE提供了更加全面的视角，特别是在检测药物代谢产物和下游效应方面。未来，随着高通量蛋白质组学技术和人工智能在蛋白质识别和分析中的应用，SPICE有望成为药物发现和开发中的重要工具，为药物作用机制的研究提供更加精准和全面的数据支持。