综述：通过生物物理技术进行药物发现：方法与应用

《Pharmacology & Therapeutics》：Drug discovery through biophysical techniques: Methods and applications

系统总结药物研发中FRET、SPR、ITC等生物物理技术的原理、优势及局限，探讨自动化与高通量发展对精准医学的推动作用。

　　

周银浩|胡海云|黄秋燕|唐宇伟|刘彦丽

江苏省脑疾病药物发现与转化研究重点实验室，江苏省精准诊断与治疗发展工程研究中心，苏州国际脑疾病诊疗联合实验室，苏州大学药学院，中国江苏省苏州市215123

摘要

药物发现的迅速进步凸显了对先进分析方法的需求，这些方法能够提供关于分子相互作用的全面见解，从而加速创新治疗剂的开发。随着现代药物发现越来越依赖于分子动力学和蛋白质行为的精确表征，生物物理技术已成为药物开发中不可或缺的工具。这些技术为研究蛋白质-配体相互作用、阐明结构基础以及解读细胞机制提供了强大的平台——这些都是合理药物设计的关键组成部分。在这篇综述中，我们系统地总结了当前药物发现中起重要作用的生物物理技术，包括F?rster共振能量转移（FRET）、荧光极化（FP）、热位移测定（TSA/CETSA）、表面等离子体共振（SPR）、生物层干涉测量（BLI）、微尺度热泳（MST）、等温滴定量热法（ITC）、核磁共振（NMR）、X射线晶体学以及基于质谱（MS）的先进技术，如氢-氘交换质谱（HDX-MS）和交联质谱（XL-MS）。对于每种技术，我们追溯了其历史发展，概述了基本原理，并强调了在药物研究中巩固其作用的关键创新。我们还客观评估了每种方法的优点和局限性，并讨论了新兴趋势，包括灵敏度、自动化和高通量实现的改进。这些发展有望继续在推动生物医学研究和治疗创新方面发挥关键作用，特别是在应对日益复杂的药物靶标和精准医疗需求的背景下。

引言

药物发现从偶然观察到一门精确的跨学科科学转变，这一进程是由阐明疾病机制和药理作用背后的分子相互作用的需求所推动的。尽管早期的生化测定和体内模型建立了基础框架，但它们往往缺乏捕捉微妙结合动力学或原子级结构信息所需的灵敏度和分辨率。生物物理技术的引入代表了重大的进步，使得能够进行实时的、定量的、无标记的分析（Renaud等人，2016年）。诸如X射线晶体学和核磁共振（NMR）光谱等开创性方法为结构生物学奠定了基础，并促进了基于结构的药物设计。后续的发展，包括表面等离子体共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）和微尺度热泳（MST），改进了结合动力学和热力学的量化，显著提高了生物分子相互作用研究的精度。进一步的创新，如氢-氘交换质谱（HDX-MS）和交联质谱（XL-MS），解决了探测蛋白质动力学和相互作用网络中的持续挑战。同时，热位移测定（TSA）和细胞热位移测定（CETSA）有助于将体外观察结果与细胞环境联系起来，增强了机制见解的转化相关性。

在这篇综述中，我们系统地概述了支撑现代药物发现的关键生物物理技术，包括F?rster共振能量转移（FRET）、荧光极化（FP）、TSA/CETSA、SPR、生物层干涉测量（BLI）、MST、ITC、NMR、X射线晶体学以及基于质谱（MS）的先进技术，如HDX-MS和XL-MS。我们概述了这些技术的历史发展和基本原理，强调了在药物研究中巩固其重要作用的关键创新。然后，我们对每种方法的优点、局限性和最佳应用场景进行了客观评估。最后，我们讨论了新兴趋势和未来方向，包括检测灵敏度、自动化和高通量实现的改进。这些进展有望继续加强生物物理方法在生物医学研究和治疗开发中的关键作用，特别是在面对日益复杂的靶标和精准医疗需求的背景下。

部分摘录

F?rster共振能量转移（FRET）

F?rster共振能量转移（FRET，也称为荧光共振能量转移）是一种依赖于距离的光学传感技术，能够实时研究分子相互作用（例如蛋白质-蛋白质、DNA-蛋白质）和构象变化。该技术通过两个荧光团之间的非辐射能量转移来实现：一个供体和一个受体。有效的FRET需要三个关键条件：（1）供体和受体之间的空间接近度（1-10纳米）

表面等离子体共振（SPR）

表面等离子体共振（SPR）是一种无标记的、实时的光学传感技术，用于研究分子相互作用（例如蛋白质-药物、抗体-抗原）。SPR依赖于金属薄膜（例如金）和介电介质界面处的光学现象。当光线以特定角度和波长照射到金属表面时，会激发自由电子的集体振荡（表面等离子体），导致反射光强度急剧下降。

等温滴定量热法（ITC）

等温滴定量热法（ITC）是一种通过直接测量结合过程中的热量交换来量化生物分子相互作用的金标准技术。通过捕获与分子相互作用相关的焓变（ΔH），ITC提供了关于结合亲和力（K_d）、化学计量比（n）和热力学参数（ΔH和ΔS）的全面见解（Johnson，2021年）。在过去二十年里，ITC已成为阐明能量学的重要工具

结论性评论

生物物理技术在药物发现中变得至关重要（Huang, Chen, Xiao, Shang, & Liu, 2024; Liu, Liu, Qin, Xu, & Min, 2014），然而没有一种方法能够完全表征药物-靶标相互作用，这些相互作用涉及亲和力、动力学、热力学和动力学（表1和表2）。靶标的日益复杂性——例如无序蛋白质和膜受体——进一步需要综合方法。例如，将ITC与FP或BLI结合使用可以平衡灵敏度和通量；

CRediT作者贡献声明

周银浩：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿。胡海云：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿。黄秋燕：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿。唐宇伟：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿。刘彦丽：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，监督，项目管理，资金获取，概念构思。

未引用的参考文献

Kretschm.E和Raether, H., 1968

Lee, Huang, Teh和Ng, 2019

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32271309）和江苏省高等教育机构的优先学术计划发展（PAPD）资助项目的支持。由于篇幅有限，作者对未能在本文中引用某些原始工作的研究人员表示歉意。