基于维伦岑斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）PAC1菌株产生的次级代谢产物——壳聚糖的抗菌表面涂层的研发，旨在延长金柑（Citrus aurantiifolia，俗称青柠）的保质期

《Postharvest Biology and Technology》：Formulation of Bacillus velezensis strain PAC1 secondary metabolites-chitosan based antimicrobial surface coating for increasing the shelf life of Citrus aurantiifolia (Lime)

环境生物技术实验室从 BHU 校园土壤中分离出对临床相关耐药菌具有拮抗作用的 bacillus 孵子属菌株 PAC1，经生化测试和 16S rDNA 序列分析鉴定为 Bacillus velezensis。通过乙醚萃取其胞外代谢物，高分辨质谱（HRAMS）鉴定出多组分抗菌/抗氧化化合物。将上述代谢物与壳聚糖结合制成涂层，应用于柠檬（Citrus aurantiifolia）表面，实验显示涂层组在腐烂率、失重率、汁液含量、酸度、硬度、可溶性固形物及 DPPH 抗氧化活性等指标上均显著优于对照组，有效延长后熟保鲜期。

　　这项研究聚焦于从土壤样本中分离出具有潜在拮抗作用的细菌，并评估其抗菌活性，同时探索其在延长易腐食品保质期中的应用。随着全球对高效抗菌/抗氧化涂层的需求不断上升，尤其是在延长易腐水果如青柠的保鲜期方面，寻找自然来源的抗菌物质成为解决食品保存问题的重要途径。青柠作为一种非呼吸性季节性水果，通常在特定季节生产，但全年都有需求。因此，开发一种环保、高效且成本可控的保鲜方法显得尤为迫切。

土壤中的微生物种类繁多，受到环境条件和地理区域的影响，是生态系统的重要组成部分。土壤细菌作为微生物群落中最丰富的成员，不仅在维持生态平衡中发挥关键作用，同时也是生物活性次级代谢产物的重要来源。这些次级代谢产物在药物研发、环境污染治理以及作物生产等多个领域具有广泛的应用。土壤细菌在抗菌活性物质的提取和生产方面具有显著优势，不仅因为其易于分离和培养，还因为其对环境和农业产量的潜在影响较小。此外，土壤细菌所分泌的抗菌物质通常具有多种功能，如抑制病原菌、减少微生物生长，以及具有抗氧化等特性。

研究中采用的抗菌活性评估方法包括多种平板实验、MTT实验（3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）和显微观察技术。通过这些方法，研究人员筛选并鉴定出具有显著抗菌活性的菌株，其中PAC1菌株表现出最强的抗菌效果。PAC1菌株被鉴定为 Bacillus velezensis，属于 Bacillaceae 家族。该菌株不仅具有广泛的抗菌活性，还能产生多种抗氧化物质，这使其在食品保存领域具有巨大潜力。

在进一步研究中，研究人员利用高效分辨率准确质量质谱（HRAMS）分析技术，从PAC1菌株的培养上清液中分离出多种抗菌和抗氧化化合物。这些化合物在乙酸乙酯提取后，被加入以壳聚糖为基础的表面涂层溶液中，用于对青柠进行涂覆。实验结果显示，经过涂覆的青柠在多个指标上表现出显著优于未涂覆青柠的保鲜效果。这些指标包括腐烂率、重量损失、汁液产量、可滴定酸度、硬度、总可溶性固形物含量、DPPH自由基清除活性以及颜色分析。通过这些测试，研究人员确认了涂覆青柠的保鲜效果得到了有效提升。

壳聚糖作为一种天然的线性聚合物，由（1,4）-连接的2-氨基脱氧-β-d-葡萄糖组成，具有一个主要的氨基基团和两个自由的羟基基团，这些基团可以与其他聚合物材料相互作用。壳聚糖涂层因其优异的特性，如形成薄膜、对食品的安全性、自身的抗菌活性以及能够与多种抗菌物质如精油、纳米颗粒、次级代谢产物等协同作用，成为食品保存中的重要材料。通过将抗菌物质与壳聚糖结合，研究人员开发出一种新型的食品涂层，能够在保持青柠原有品质的同时，有效延长其保质期。

此外，研究还强调了天然抗菌物质在食品保存中的重要性。与传统的化学防腐剂相比，天然来源的抗菌物质不仅具有更高的安全性，还能够减少对环境和人体的潜在危害。同时，这些物质往往具有多种功能，如抗菌、抗氧化、抗真菌等，这使其在食品保存中具有更广泛的应用前景。通过利用土壤中的天然微生物资源，研究人员成功提取出具有抗菌和抗氧化活性的化合物，并将其应用于食品涂层中，为延长易腐食品的保质期提供了新的解决方案。

在实验过程中，研究人员采用了一种名为“拥挤平板法”的技术，通过对土壤样本进行连续稀释，分离出具有拮抗作用的细菌菌株。这种方法不仅能够有效筛选出具有抗菌活性的菌株，还能确保菌株的纯度和活性。通过这种方法，研究人员成功分离出三种菌株：PAC1、S2A3和S2AB2。这些菌株在对其他细菌菌落的抑制作用方面表现出显著差异，其中PAC1菌株的抗菌活性最强。

为了进一步验证PAC1菌株的抗菌效果，研究人员采用交叉划线/孔扩散琼脂法进行实验。该方法能够直观地展示菌株的抗菌活性，并通过测量抑制区的大小来评估其效果。实验结果显示，PAC1菌株对多种常见病原菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和李斯特菌等，均表现出显著的抗菌活性。此外，PAC1菌株还对某些真菌病原菌，如青霉菌和曲霉菌等，表现出一定的抑制作用。

在抗菌物质的提取过程中，研究人员采用了乙酸乙酯作为提取溶剂，通过离心和过滤等步骤，从培养上清液中分离出具有抗菌和抗氧化活性的化合物。这些化合物在HRAMS分析中被鉴定为多种天然存在的生物活性物质，如黄酮类、皂苷类、植物甾醇类、酚酸类、抗菌肽类、单宁类、萜类等。这些物质不仅具有抗菌作用，还能够减少氧化反应，从而延缓食品的变质过程。

通过将这些生物活性物质与壳聚糖结合，研究人员开发出一种新型的食品涂层。这种涂层能够有效减少青柠的水分流失和呼吸作用，同时抑制微生物的生长，从而延长其保质期。实验结果表明，经过涂覆的青柠在多个关键指标上表现出显著优于未涂覆青柠的保鲜效果。这些指标包括腐烂率、重量损失、汁液产量、可滴定酸度、硬度、总可溶性固形物含量、DPPH自由基清除活性以及颜色分析。通过这些测试，研究人员确认了涂层的有效性，并为未来食品保存技术的发展提供了新的思路。

此外，研究还强调了利用天然微生物资源的重要性。与传统的化学防腐剂相比，天然来源的抗菌物质不仅具有更高的安全性，还能够减少对环境和人体的潜在危害。同时，这些物质往往具有多种功能，如抗菌、抗氧化、抗真菌等，这使其在食品保存中具有更广泛的应用前景。通过利用土壤中的天然微生物资源，研究人员成功提取出具有抗菌和抗氧化活性的化合物，并将其应用于食品涂层中，为延长易腐食品的保质期提供了新的解决方案。

在实验过程中，研究人员采用了多种技术手段，包括传统的平板实验、MTT实验和显微观察技术，以评估抗菌活性。同时，利用HRAMS分析技术，对提取的化合物进行了详细鉴定。这些技术手段不仅能够准确评估抗菌效果，还能为后续研究提供重要的数据支持。通过这些技术，研究人员能够更好地理解抗菌物质的作用机制，并为其在食品保存中的应用提供科学依据。

综上所述，这项研究成功从土壤样本中分离出具有显著抗菌活性的 Bacillus velezensis 菌株 PAC1，并通过提取其抗菌/抗氧化化合物，将其应用于以壳聚糖为基础的食品涂层中，有效延长了青柠的保鲜期。这一研究不仅为食品保存技术提供了新的思路，也为利用天然微生物资源开发环保、高效的食品保鲜方法奠定了基础。未来，随着对天然抗菌物质研究的深入，其在食品保存中的应用将更加广泛，并有望成为替代传统化学防腐剂的重要手段。