在减少施肥的条件下，镁通过调节碳循环微生物来增强土壤的碳封存能力

《Scientia Horticulturae》：Magnesium enhances soil carbon sequestration by modulating carbon-cycling microorganisms under reduced fertilisation conditions

土壤有机碳（SOC）在集约化施肥茶园持续下降，本研究通过比较传统施肥（FF）、优化施肥（OF）和镁补充优化施肥（OF+Mg）发现，镁补充显著提高SOC 19.5%，改善土壤pH（提升15.4%）、可交换镁（89.4%）和钙（102.3%），并增强碳稳定相关酶（AAs、CBMs、PLs）活性。机制包括镁增强土壤缓冲能力、促进有益菌群（Bradyrhizobium、Mycobacterium）增殖，抑制分解菌（Rhodanobacter）和有机碳流失。

　　土壤有机碳（SOC）的流失一直是高强度施肥茶园面临的核心挑战。为了评估不同施肥策略对土壤性质、微生物碳循环功能以及SOC动态的影响，我们比较了三种施肥方式：传统农民施肥（FF）、优化施肥（OF）以及优化施肥结合镁补充（OF+Mg）。研究结果显示，与传统施肥相比，优化施肥在提高养分供应方面效果有限，但未能提升土壤pH值或阻止SOC的下降，表明养分输入与有机质保持之间仍存在不平衡。相反，OF+Mg不仅提升了土壤pH值，还增加了交换性镁和钙的含量，降低了铵浓度，并逆转了SOC的损失，相较于OF，实现了SOC增加19.5%的显著效果。宏基因组分析表明，碳循环功能基因从糖苷水解酶向辅助活性酶、碳水化合物结合模块和多糖裂解酶转移，这与增强碳稳定性的趋势一致。冗余分析和结构方程模型（SEM）进一步确认了交换性镁和碳循环酶类群（AAs、PLs）作为SOC固存的关键驱动因素。

在中国，茶种植面积约为310万公顷，是全球最大的茶种植区域。然而，茶园土壤本身具有较强的酸性，加上温暖湿润的气候条件和高强度的施肥行为，导致SOC的快速流失。尽管如此，茶园土壤仍具有显著的碳固存潜力，尤其是在通过修剪残留物等方式将有机质重新输入土壤的过程中。研究团队在福建省安溪县的一个主要茶产区进行了为期两年的试验，以评估不同施肥策略对土壤性质、碳循环微生物群落及SOC动态的影响。该地区属于亚热带季风气候，年平均气温为20.3°C，2022至2023年的总降水量分别为1349毫米和1313毫米。土壤类型为酸性红壤，表层土壤（0-20厘米）的初始性质包括pH值3.89、SOC含量15.95克/千克、铵态氮（NH4?-N）18.59毫克/千克、硝态氮（NO3?-N）17.25毫克/千克、速效磷（P）108.1毫克/千克和速效钾（K）171.22毫克/千克。

试验设计采用了三种施肥策略：常规农民施肥（FF）、优化施肥（OF）以及优化施肥加镁（OF+Mg）。每个处理区的面积为20平方米，每种处理有四个生物重复。处理区在块内随机排列，并通过0.5米的缓冲带隔离，以减少边缘效应和肥料飘移的影响。茶树品种为铁观音（Camellia sinensis cv. Tieguanyin），行距为80厘米，株距为35厘米。施肥方式每年进行三次，分别对应茶树的生长周期：30%作为基肥（12月），20%作为春季追肥（3月中旬），50%作为秋季追肥（8月下旬）。FF处理遵循传统施肥量，即每公顷施用300千克氮（尿素，含46%氮）、100千克磷（磷酸二铵，18–46–0）和125千克钾（氯化钾，含60% K2O），不添加镁。OF处理采用降低并平衡的施肥量（240千克/公顷氮、80千克/公顷P2O5、100千克/公顷K2O），基于土壤养分状况和作物需求。OF+Mg处理则采用与OF相同的NPK方案，但额外添加35千克/公顷氧化镁（MgO，相当于21.1千克/公顷的Mg）作为基肥。

除了施肥处理外，其他农业实践在所有处理中保持一致，包括每年两次的修剪（3月中旬和8月中旬，距离收获前45天），修剪后25天使用农药，以及在4月、6月、8月和9月使用除草剂进行杂草控制。土壤样品在茶树收获后从行间采集，避开肥料施用路径和根系区域。样品分层采集（0-20厘米），去除污染物后充分混合。制备两个样品，一个自然风干，另一个通过10目筛去除根系、石块和其他杂质，随后运送到实验室进行理化分析。修剪残留物的采样在每年修剪后进行，所有样品均从茶树行间收集，并在每个处理区的相同相对位置取样，以确保处理间的可比性。收集的残留物在65°C下烘干至恒重，随后称重以确定生物质输入。子样经过研磨后，使用重铬酸钾氧化法结合外部加热进行有机碳含量的测定。

土壤样品的分析方法包括使用电位计法测定土壤pH值，采用重铬酸钾氧化法（Walkley–Black方法）测定SOC含量。铵态氮（NH4?-N）通过氯化钾提取并使用连续流动分析仪（SEAL Analytical AA500 segmented flow analyzer）进行测定。可交换的镁和钙则通过乙酸铵提取，并使用原子吸收光谱法测定。微生物生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸-提取法测定，具体操作包括将10克新鲜土壤与3毫升无水氯仿混合，然后离心。未与氯仿混合的土壤样品作为对照（CK）。样品在黑暗中37°C下孵育24小时后，用0.5摩尔/升硫酸钾溶液提取，摇匀并离心。通过重铬酸钾氧化后，使用硫酸亚铁滴定法测定滤液中的有机碳含量。MBC计算公式为MBC = Ec/KEC，其中Ec代表熏蒸与未熏蒸提取物之间的有机碳差异，KEC为转换因子（0.38）。溶解性有机碳（DOC）通过用25毫升去离子水提取5克土壤，过滤后使用总有机碳分析仪测定。易氧化有机碳（ROC/POXC）则采用高锰酸钾氧化法测定，具体方法是将2克土壤与25毫升0.333摩尔/升高锰酸钾溶液（土壤:溶液=1:25）混合，摇晃2分钟，稀释后在565 nm波长下进行比色测定。每消耗1毫摩尔高锰酸钾，假设可氧化9毫克碳。

宏基因组DNA提取使用OMEGA Mag-Bind Soil DNA Kit，随后在-20°C下保存。使用Qubit? 4荧光计和琼脂糖凝胶电泳评估DNA的量和质量。构建宏基因组文库时采用Illumina TruSeq Nano DNA LT Kit，并在Illumina NovaSeq平台上进行测序（PE150）。原始测序数据经过预处理，去除接头序列并编辑低质量序列。使用BMTagger去除宿主来源的序列。通过Kraken2进行分类学分析，基于RefSeq数据库，包括古菌、细菌、病毒、真菌、原生动物、动物和绿植，之后排除动物和绿植序列。非冗余contigs通过mmseqs2进行分类，使用NCBI-nt数据库，并排除来自绿植和动物的contigs。基因预测使用MetaGeneMark，编码序列（CDSs）通过mmseqs2进行聚类（easy-cluster模式，90%序列同源性和90%覆盖度）。基因丰度使用Salmon在准映射模式下估算，并归一化为每千碱基每百万拷贝。功能注释通过将非冗余基因与KEGG、EggNOG和CAZy数据库对齐完成。EggNOG和GO术语的补充注释使用EggNOG-mapper（v2），而KO术语使用KOBAS进行注释。

数据整理使用Microsoft Excel 2023，统计分析包括单因素方差分析（ANOVA）和皮尔逊相关性分析，均在SPSS（v17.0）中进行。事后比较使用Tukey’s HSD检验，显著性水平为p < 0.05。图形表示，如柱状图和散点图，使用OriginPro（v2021）生成。微生物群落分析在R（v4.4.2）中进行，冗余分析（RDA）使用vegan包（v2.6–4），通过999次置换检验显著性，图形输出使用ggplot2（v3.5.1）。随机森林回归（RF）使用randomForest包（v4.7–1.1）进行，模型构建时设置ntree = 1000，mtry = √p（土壤性质）或mtry = p/3（基因特征），变量重要性报告为均方误差的百分比增加（IncMSE %）。偏最小二乘结构方程模型（PLS-SEM）使用plspm包（v0.4.9）进行，以探讨施肥处理、土壤性质、微生物群落、功能基因与SOC池之间的因果路径。模型拟合度通过适合度指数（GFI）和近似误差均方根（RMSEA）评估。模型表现出良好的拟合度（χ2 = 7.76，df = 9，p = 0.57；GFI = 0.98；RMSEA < 0.001），表明模型与观测数据之间无显著差异。5000次自助抽样用于生成路径系数的置信区间。双图（biplot）用于可视化RDA结果，土壤理化变量显示为蓝色箭头，微生物指标或功能基因显示为红色箭头。随机森林回归进一步量化了SOC的预测因子，结构方程模型揭示了土壤pH值、可交换阳离子和微生物功能群在镁添加对SOC动态影响中的中介作用。微生物系统发育分析使用microeco（v1.1.0）、tidytree（v0.4.6）和ggtree（v3.10.0）包进行。系统发育树和线性判别分析（LDA）得分图用于表征不同施肥处理下的群落结构和功能贡献。

试验结果表明，三种施肥策略在两年实验期间对土壤性质和碳池产生了显著影响。OF和OF+Mg在改善土壤酸性和养分可用性方面优于FF，其中OF+Mg的效果最为显著。OF+Mg处理下，土壤pH值在2023年增加了15.4%，在2024年增加了12.2%（p < 0.05），同时交换性Mg和Ca的含量也显著提高，分别达到89.4%和102.3%（p < 0.05）。此外，OF+Mg显著降低了NH4?-N的含量，两年内分别降低了37%以上（p < 0.05），同时适度增加了修剪残留物的生物量，分别提高了11.5%和25.7%（p < 0.05），表明有机输入的增强。土壤碳池方面，OF+Mg处理显著增加了SOC的总量，分别比OF增加了19.5%和15.6%（p < 0.05）。然而，易分解的碳池如ROC和POC在2024年的OF+Mg处理下未见改善，甚至低于OF处理。DOC含量在OF和OF+Mg处理下均显著低于FF处理（p < 0.05），表明碳淋失的减少。MBC在各处理间保持稳定，表明微生物生物量未受到显著影响。

施肥处理显著改变了土壤碳循环功能基因的丰度和组成。冗余分析（RDA）和基于CAZy数据库的相对丰度分析显示，镁肥的应用增加了与有机质降解相关的基因（如AAs、CBMs和PLs）的相对丰度，同时减少了GHs的丰度。土壤pH值、Ca和Mg与GHs呈负相关，而CBMs则与这些土壤化学因素呈强正相关。AAs和PLs与SOC和DOC呈中度相关，但未达到显著水平。这些趋势得到了R2值的支持，其中pH（0.74）、Ca（0.54）和Mg（0.47）是显著的环境驱动因素（p < 0.05）。在2024年，RDA1和RDA2分别解释了74.5%和7.7%的总变异。GHs与土壤化学因素呈负相关，而CBMs呈正相关。DOC的影响增加（R2 = 0.51，p = 0.047），同时pH（R2 = 0.65）、Ca（R2 = 0.79）和Mg（R2 = 0.85）均达到统计学显著水平（p < 0.01）。

镁肥对碳循环基因的富集可能反映了微生物群落向更高效的碳分解途径转变。AAs、CBMs和PLs的相对丰度在镁肥处理下显著增加，而GHs的丰度则下降。GHs广泛分布于碳矿化过程中，其减少可能表明快速碳损失的降低，以及向更稳定的碳循环路径的转变。此外，镁肥可能促进了微生物的活性和代谢，提高了与碳循环相关的酶类的表达，从而加速了复杂有机底物的分解和转化。镁肥还可能通过改变微生物群落结构，促进与碳分解和养分循环相关的功能类群的增殖，如Bradyrhizobium、Mycobacterium和Edaphobacter。这些变化强化了生态系统层面支持稳定SOC积累的过程。

镁肥对土壤微生物群落的组成产生了显著影响，通过分类学分析和多变量分析（如图5和图6所示）。主要的微生物属包括Bradyrhizobium、Trebonia、Edaphobacter、Mycobacterium和Rhodanobacter，每个属在土壤养分循环和环境相互作用中发挥不同的作用。在OF+Mg处理下，Bradyrhizobium的丰度显著增加，这是一种著名的固氮属，有助于土壤-植物间的氮素交换。以前的研究也表明，Bradyrhizobium可以减少硝rous氧化（N?O）排放，通过促进完全脱氮作用。相比之下，Trebonia的丰度在镁肥处理下显著减少，这种酸性土壤中的细菌与土壤pH值的变化一致，表明Trebonia可能作为酸性土壤条件的指示属。Edaphobacter的相对丰度在镁肥处理下也增加，该属适应环境胁迫，并在森林和酸性土壤中较为常见。考虑到研究地点的亚热带湿润气候，其高降雨量和温度，Edaphobacter的增殖可能反映了其在镁肥改善土壤通气性和结构后的生态优势。尽管具体机制尚不明确，但其耐受性表明其在长期土壤微生物稳定性中的潜在作用。Mycobacterium广泛分布在陆地和水生环境中，参与复杂有机基质如腐殖质和植物来源材料的分解，有助于有机质矿化和养分循环。某些Mycobacterium菌种还具有降解土壤污染物的酶活性，凸显其在生物修复中的相关性。相反，Rhodanobacter的丰度在镁肥处理下减少，该属代谢多样，能够进行硝化和脱氮作用，可能对氮素损失和气体氮排放产生潜在影响。镁肥处理下Rhodanobacter的减少与土壤NH4?-N浓度的降低相吻合，表明氮素循环路径向更保守的方向转变。

镁肥通过物理、化学和生物途径促进SOC循环（图7）。首先，镁肥改善酸性茶园土壤的化学环境，提高pH值，为微生物繁殖和酶活性创造更有利的条件。这种缓冲作用在酸性土壤中尤为重要，因为微生物过程常常受到限制。与之前的研究结果一致，镁肥的施用减少了土壤NH4?-N的含量，可能缓解了氮诱导的微生物压力，提高了微生物碳利用效率。其次，镁作为微生物酶系统中的辅因子，促进了参与有机质分解的关键酶类（如AAs、PLs和CBMs）的合成和活性。镁肥显著增加了这些酶类基因的丰度，从而加速了复杂有机基质的分解和转化。第三，镁肥改变了微生物群落结构，有利于与碳分解和养分循环相关的功能类群的增殖，如Bradyrhizobium、Mycobacterium和Edaphobacter。这些变化强化了生态系统层面支持稳定SOC积累的过程。此外，镁肥促进了根系生长，增加了根系分泌物的释放，为微生物活动和基因表达提供了可利用的碳底物。增强的根系生物量还支持了根际微生物的多样性和功能，有助于改善养分周转和SOC输入。最后，镁肥提高了光合作用效率和整体植物生产力，从而增加了植物来源的碳输入到土壤系统中。

研究还指出了一些局限性。尽管本研究测量了颗粒有机碳（POC），但进一步将其分解为与矿物结合的有机质（MAOM）和封闭颗粒有机质（O-POM/i-POM）有助于更精确地解析SOC稳定化的机制。同样，直接测量Fe/Al氧化物和矿物-有机结合物仍是验证SOC保护机制的必要步骤。此外，虽然研究结果表明镁肥的施用具有明显优势，但在不同土壤气候条件和更长的时间框架下，潜在风险如镁积累和与钾、钙的离子拮抗作用仍需进一步研究。

综上所述，镁肥的施用通过改善土壤化学性质、刺激功能微生物群落、提高酶活性以及增加植物来源的碳输入，增强了SOC的循环。这些协同效应不仅促进了SOC的转化，还加强了茶园生态系统长期碳固存的潜力。未来的研究应重点整合镁肥与其他可持续实践（如秸秆还田、生物炭或石灰的使用），在多样化的土壤气候条件下进行多点长期试验，并采用宏基因组学、宏转录组学、同位素追踪和SOC分馏（MAOM vs. POM）等先进技术，以更好地揭示潜在机制。此外，将这些农业实践与生命周期评估和政策框架相结合，对于评估其可扩展性、经济可行性和对农业系统碳中和目标的贡献至关重要。