在甜瓜中鉴定NPF基因家族，并对CmNPF7.3在赋予耐盐性方面的功能进行分析

《Scientia Horticulturae》：Identification of the NPF gene family in melon and functional analysis of CmNPF7.3 in conferring salt tolerance

本研究鉴定了56个黄瓜NPF家族基因，系统分析其染色体分布、理化特性、系统发育及顺式作用元件，发现CmNPF7.3在耐盐品种中显著上调，且定位于质膜。过表达该基因能提高根和茎部硝酸盐吸收量，增强抗氧化酶活性及光合效率，显著提升耐盐性。

　　### 水稻中的NPF基因家族研究及其在盐胁迫中的作用

盐胁迫是影响西瓜（*Cucumis melo* L.）产量和品质的重要非生物胁迫之一，对西瓜产业的健康和可持续发展构成严重威胁。在植物中，硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族（NPF）蛋白是调节硝酸盐吸收和分布的重要转运蛋白，有助于提高氮素利用效率。此外，一些NPF基因还能够介导肽类和激素的跨膜运输，从而调控植物的生长发育，增强其对外部胁迫的抵抗能力，特别是对盐胁迫的适应性。因此，研究NPF基因家族在西瓜中的作用，对于揭示植物盐胁迫响应的分子机制具有重要意义。

#### 1. 研究背景

西瓜作为一种一年生的葫芦科植物，因其根系较浅，对盐胁迫、干旱和水淹等非生物胁迫极为敏感。全球范围内，西瓜的产量在2023年估计达到2950万吨，种植面积约为1092350公顷。中国是最大的西瓜生产国，产量达到1450万吨，其次是印度、土耳其、哈萨克斯坦和巴西。由于西瓜对盐分的敏感性，盐碱土壤的改良和利用成为国际生物技术研究中的重要课题。尽管合理排水、淡水淋洗和化学土壤改良等方法可以在一定程度上缓解盐碱化问题，但这些方法往往成本高昂，效果有限。因此，挖掘盐胁迫耐受基因并培育耐盐品种成为提高西瓜抗逆性的关键途径。

在盐碱土壤中，钠离子（Na?）和氯离子（Cl?）是主要的盐分成分，占可溶性盐分的50%-80%。过量的Na?积累会干扰植物对钙离子（Ca2?）和镁离子（Mg2?）等必需元素的吸收，导致营养缺乏并加剧代谢紊乱。同时，过量的Cl?积累也会引发阴离子毒性，严重损害植物生长。除了离子毒性，盐胁迫还会引发氧化损伤。高盐浓度干扰了叶绿体和线粒体中的电子传递系统，加速电子泄漏，促进活性氧（ROS）的产生。ROS的过量积累会导致叶绿素降解，并阻碍氨基酸末端、蛋白质、脂质等物质的合成，从而影响植物的酶促和非酶促反应。植物的抗氧化防御系统可以有效缓解氧化损伤，超氧化物歧化酶（SOD）将超氧阴离子转化为H?O?和O?，而H?O?则可以被过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）清除。这些酶协同作用，维持植物体内自由基的稳定水平。

氮素是植物生长发育不可或缺的元素，是叶绿素、酶、氨基酸、核酸、激素、渗透调节物质等重要生物分子的关键组成部分。在盐胁迫条件下，氮素营养能够通过刺激关键生物分子的合成、促进营养生长或减少叶片脱落，提高植物的生物量，从而稀释盐分，减轻离子毒性，增强抗氧化能力，并改善胁迫耐受性。在豌豆、向日葵、玉米、西瓜、番茄和萝卜等植物中，硝酸盐营养的应用显著提高了其在盐胁迫条件下的耐受能力。

#### 2. 研究方法

本研究使用了多种技术手段，对西瓜中的NPF基因家族进行了系统分析。首先，从拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）基因组数据库中获取了NPF基因家族的蛋白质序列，并利用TBtools软件进行BLASTP分析，以确定西瓜基因组中的NPF基因成员。随后，通过Pfam数据库验证了候选蛋白中是否存在保守结构域，特别是PTR2结构域（Pfam编号：PF00854）。

为了进一步分析NPF基因的染色体定位和理化特性，使用TBtools软件确定了西瓜NPF基因在染色体上的分布，并通过ProtParam工具分析了其氨基酸数目、分子量和等电点（pI）。此外，利用WoLF PSORT预测了NPF蛋白的亚细胞定位。在系统进化分析中，使用Clustal Omega软件构建了NPF基因的系统发育树，并通过Interactive Tree of Life（iTOL）平台进行可视化和优化。

为了研究NPF基因的保守结构域、基因结构和启动子中的顺式作用元件，利用MEME Suite预测了保守结构域，并使用TBtools软件进行可视化。启动子中的顺式作用元件分析通过PlantCARE数据库进行，以识别与植物激素信号和外部胁迫响应相关的调控元件。为了分析NPF基因在盐胁迫下的表达模式，使用了转录组测序数据，并通过FPKM（每百万映射读数每千碱基转录物的片段数）方法量化基因表达水平。差异表达基因（DEGs）的鉴定采用P值<0.05和|log2（fold change）|≥1作为筛选标准。利用TBtools软件生成了热图以可视化NPF基因的表达模式。

为了验证CmNPF7.3的功能，进行了稳定的转基因拟南芥实验和由根癌农杆菌（*Agrobacterium rhizogenes*）介导的转录瞬时转化实验。实验过程中，采用花浸法获得转基因拟南芥植株，并通过抗生素筛选获得纯合的T3代植株。实验条件设置为恒温22℃，相对湿度70%，光周期为16小时光照和8小时黑暗。为了评估盐胁迫耐受性，将转基因植株和对照植株在含有250 mM NaCl的培养基中培养4周后进行盐处理。为了检测根系生长情况，将OE和VC种子在MS琼脂平板上萌发，5天后将生长一致的幼苗转移到含有或不含100 mM NaCl的MS琼脂平板上。通过观察根系长度评估盐胁迫下的生长变化。

为了检测植物的生理和生化指标，使用IMAGING-PAM叶绿素荧光仪检测叶绿素荧光，并通过WinGegE软件分析最大光合系统II量子效率（Fv/Fm）。使用3,3′-二氨基苯基-2-肼（DAB）和硝基蓝四氮唑氯化物（NBT）染色法检测活性氧（ROS）积累情况。SOD、POD和CAT的活性以及丙二醛（MDA）和H?O?的含量均按照相应的试剂盒说明进行测定。所有实验均重复三次以确保结果的可靠性。

为了测量硝酸盐（NO??）浓度，使用离子色谱法（IC）结合电导率检测（CD）进行分析。在盐处理后，测量了OE和VC植株根系和地上部的NO??浓度。为了验证CmNPF7.3的表达情况，使用了qRT-PCR方法，并将西瓜的actin基因作为内参基因进行标准化处理。

#### 3. 研究结果

通过分析西瓜基因组，共鉴定出56个NPF基因，这些基因分布在11条染色体上。这些基因主要集中在染色体的远端区域，其中染色体9上分布最多（共12个NPF基因），而染色体1上没有NPF基因。通过理化特性分析，发现这些NPF蛋白的氨基酸数目在97至681之间，分子量在10.54至76.15 kDa之间，等电点（pI）在5.47至9.64之间，其中10个蛋白的pI值低于7。水溶性分析显示，所有NPF蛋白的Grand Average of Hydropathicity（GRAVY）值均为正，表明其具有亲水性。根据亚细胞定位预测，53个NPF蛋白定位于质膜，其余3个分别定位于液泡膜、细胞质和叶绿体。

系统发育分析显示，这56个CmNPF基因与拟南芥、水稻、黄瓜等植物的NPF基因家族成员一起，被划分为八个亚家族（CmNPF1-CmNPF8）。根据国际命名规则，对CmNPF基因进行了系统重命名。不同亚家族的基因分布情况如下：CmNPF1（3个）、CmNPF2（7个）、CmNPF3（2个）、CmNPF4（7个）、CmNPF5（22个）、CmNPF6（6个）、CmNPF7（5个）和CmNPF8（4个）。CmNPF1和CmNPF2亚家族在系统发育树上位于同一分支，而CmNPF7与CmNPF8较为接近，表明它们具有较近的进化关系。这些结果与常见小麦、棉花、烟草和黄瓜等植物的NPF基因分类结果一致。

保守结构域分析显示，56个CmNPF蛋白中存在10个保守结构域，这些结构域的组成和排列存在一定的差异，但整体上表现出高度的结构保守性。具体而言，41个CmNPF基因包含所有10个结构域，而另外15个基因则缺少1至9个结构域。基因结构分析表明，不同CmNPF基因的内含子和外显子数目、长度和分布存在差异。例如，CmNPF8.1基因包含8个内含子，而CmNPF5.21基因则没有内含子。

启动子顺式作用元件分析显示，2000 bp上游区域中存在13个与植物激素信号和外部胁迫响应相关的调控元件。这些元件包括ABRE（44个基因）、MeJARE（39个基因）、SARE（30个基因）、GARE（33个基因）和AuxRE（28个基因），表明这些基因可能具有激素诱导特性。此外，还检测到了一些响应外部刺激的顺式作用元件，包括光响应元件（LRE）、低温响应元件（LTR）、干旱响应元件（DRE）、防御和胁迫响应元件（DSRE）以及伤口响应元件（WUN）。这些结果表明，CmNPF基因可能在西瓜对多种胁迫的响应中发挥重要作用。在47个CmNPF基因的启动子中检测到了MYB结合位点，表明它们可能受到MYB转录因子的直接调控。例如，在苹果中，MdMYB10是调控果实颜色的关键转录因子，通过激活MdNRT2.4–1基因提高硝酸盐的吸收能力，从而增强果实的抗氧化能力。在西瓜中，六个CmNPF基因（CmNPF2.4、CmNPF5.15、CmNPF5.19、CmNPF6.3、CmNPF6.4和CmNPF8.4）的启动子中含有参与调控类黄酮生物合成基因的MYB结合位点，表明它们可能与类黄酮合成（与抗氧化能力和胁迫耐受性密切相关）有关。此外，23个CmNPF基因的启动子中含有干旱诱导的MYB结合位点，暗示其可能参与干旱胁迫响应。这一发现与在杨树中发现的PtoNPF7.3C和PtoNPF2.7基因在干旱胁迫下的诱导表达及其启动子中干旱诱导的MYB结合位点一致。另外，21个CmNPF基因的启动子中含有与光响应相关的MYB结合位点。在拟南芥中，AtNRT2.1和AtNRT1.1基因的表达水平在光照期间比黑暗期间高5至10倍，硝酸盐吸收能力在光照开始后显著增强。

在盐胁迫下的表达分析显示，许多NPF家族成员的表达受到显著诱导，特别是在耐盐表型的西瓜品种T103中。本研究筛选出三个显著诱导的基因（CmNPF4.2、CmNPF6.3和CmNPF7.3），其中CmNPF4.2在耐盐和敏感品种中均被诱导，但表现出不同的时间模式。在耐盐品种T103中，CmNPF4.2的诱导主要发生在24小时后，而在敏感品种T1中则在两个时间点均被诱导。CmNPF6.3在两个品种中均被下调。CmNPF7.3在耐盐品种T103中持续上调，24小时后达到显著水平，而在敏感品种T1中被下调，但4小时和24小时的表达差异不显著。这种在耐盐品种中持续上调的表达模式表明，CmNPF7.3可能在西瓜对盐胁迫的响应中发挥重要作用。通过qRT-PCR验证了这三个基因的表达模式，结果与转录组测序一致。

为了验证CmNPF7.3的功能，进行了稳定的转基因拟南芥实验和由根癌农杆菌介导的转录瞬时转化实验。使用四周大的T3代转基因拟南芥植株检测CmNPF7.3的表达水平，选择了三个表达水平较高的过表达株系（OE3、OE5和OE9）进行后续功能研究。结果显示，CmNPF7.3在OE株系中成功表达，而在对照株系（VC）中未检测到转录产物。盐处理一周后，VC株系表现出严重的生长抑制，叶片变黄并萎蔫，而OE株系的叶片黄化程度较轻。Fv/Fm值在盐处理的VC株系中显著低于OE株系，表明OE株系的光合系统II功能受到的影响较小。在盐胁迫条件下，OE株系的根长约为VC株系的1.4倍，表明CmNPF7.3的过表达增强了拟南芥的耐盐能力。

为了进一步验证CmNPF7.3的功能，进行了西瓜毛状根的转基因实验。使用含有CmNPF7.3的pCAMBIA1300-CmNPF7.3载体通过根癌农杆菌K599介导的瞬时转化技术引入毛状根中。在盐处理一周后，VC株系的毛状根生长受到严重抑制，所有叶片均变黄并萎蔫，而OE株系的叶片仅在老叶中出现黄化，嫩叶仍保持绿色。Fv/Fm值在盐处理的VC株系中显著低于OE株系，表明OE株系的光合系统II功能受到的损害较小。此外，盐处理后，OE株系的H?O?和MDA含量显著低于VC株系，表明其抗氧化能力更强。SOD、POD和CAT的活性在OE株系中也显著高于VC株系，进一步证实了CmNPF7.3在提高抗氧化能力方面的关键作用。

为了研究CmNPF7.3对硝酸盐吸收的影响，测量了盐处理后西瓜毛状根和地上部的硝酸盐浓度。结果显示，盐处理组的根系硝酸盐浓度显著低于对照组，表明盐胁迫抑制了根系对硝酸盐的吸收。然而，在OE株系中，根系硝酸盐浓度显著高于VC株系，这表明CmNPF7.3的过表达增强了根系对硝酸盐的吸收能力，部分缓解了盐胁迫的影响。此外，盐处理后，OE株系的地上部硝酸盐浓度也显著高于VC株系，表明CmNPF7.3在促进地上部硝酸盐积累方面发挥了重要作用。

#### 4. 讨论

NPF基因家族在多种植物中已被广泛研究，包括番茄、拟南芥、杨树、蒺藜苜蓿、苹果、甘蔗、棉花、水稻、黄瓜和玉米。尽管不同物种中的NPF基因数目存在差异，但其成员的蛋白质结构域高度保守，并通常被划分为八个亚家族。在西瓜中，56个CmNPF基因也被划分为八个亚家族，并按照国际命名规则进行了系统重命名。与黄瓜类似，CmNPF1、CmNPF3、CmNPF7和CmNPF8亚家族中的基因数目较少，而CmNPF5亚家族是最大的，包含22个CmNPF基因。染色体定位分析显示，CmNPF基因主要分布在染色体的末端，其中染色体6和9上的基因密度最高并呈现聚集现象。这可能意味着这些基因通过协调表达来发挥功能，尽管这种聚集可能导致功能冗余，但在强烈环境胁迫下也可能有助于缓解结构变异（如染色体断裂）带来的负面影响，从而促进其在进化过程中的保存。

启动子中的顺式作用元件可以调控目标基因的表达，通过与特定转录因子结合实现。为了探究可能调控CmNPF基因表达的因素，我们分析了其启动子区域中的顺式作用元件。结果表明，存在13个与植物激素信号和外部胁迫响应相关的调控元件。其中，ABRE、MeJARE、SARE、GARE和AuxRE等元件与植物激素信号相关，而LRE、LTR、DRE、DSRE和WUN等元件则与外部刺激响应有关。这些结果表明，CmNPF基因可能在西瓜对多种胁迫的响应中发挥重要作用。此外，47个CmNPF基因的启动子中检测到了MYB结合位点，表明它们可能受到MYB转录因子的直接调控。例如，在苹果中，MdMYB10是调控果实颜色的关键转录因子，通过激活MdNRT2.4–1基因提高硝酸盐的吸收能力，从而增强果实的抗氧化能力。在西瓜中，六个CmNPF基因（CmNPF2.4、CmNPF5.15、CmNPF5.19、CmNPF6.3、CmNPF6.4和CmNPF8.4）的启动子中含有参与调控类黄酮生物合成基因的MYB结合位点，表明它们可能与类黄酮合成（与抗氧化能力和胁迫耐受性密切相关）有关。此外，23个CmNPF基因的启动子中含有干旱诱导的MYB结合位点，暗示其可能参与干旱胁迫响应。这一发现与在杨树中发现的PtoNPF7.3C和PtoNPF2.7基因在干旱胁迫下的诱导表达及其启动子中干旱诱导的MYB结合位点一致。另外，21个CmNPF基因的启动子中含有与光响应相关的MYB结合位点。在拟南芥中，AtNRT2.1和AtNRT1.1基因的表达水平在光照期间比黑暗期间高5至10倍，硝酸盐吸收能力在光照开始后显著增强。

在盐胁迫下的表达分析显示，许多NPF家族成员的表达受到显著诱导，特别是在耐盐表型的西瓜品种T103中。本研究筛选出三个显著诱导的基因（CmNPF4.2、CmNPF6.3和CmNPF7.3），其中CmNPF4.2在耐盐和敏感品种中均被诱导，但表现出不同的时间模式。在耐盐品种T103中，CmNPF4.2的诱导主要发生在24小时后，而在敏感品种T1中则在两个时间点均被诱导。CmNPF6.3在两个品种中均被下调。CmNPF7.3在耐盐品种T103中持续上调，24小时后达到显著水平，而在敏感品种T1中被下调，但4小时和24小时的表达差异不显著。这种在耐盐品种中持续上调的表达模式表明，CmNPF7.3可能在西瓜对盐胁迫的响应中发挥重要作用。通过qRT-PCR验证了这三个基因的表达模式，结果与转录组测序一致。

为了验证CmNPF7.3的功能，进行了稳定的转基因拟南芥实验和由根癌农杆菌介导的转录瞬时转化实验。使用四周大的T3代转基因拟南芥植株检测CmNPF7.3的表达水平，选择了三个表达水平较高的过表达株系（OE3、OE5和OE9）进行后续功能研究。结果显示，CmNPF7.3在OE株系中成功表达，而在对照株系（VC）中未检测到转录产物。盐处理一周后，VC株系表现出严重的生长抑制，叶片变黄并萎蔫，而OE株系的叶片黄化程度较轻。Fv/Fm值在盐处理的VC株系中显著低于OE株系，表明OE株系的光合系统II功能受到的影响较小。在盐胁迫条件下，OE株系的根长约为VC株系的1.4倍，表明CmNPF7.3的过表达增强了拟南芥的耐盐能力。

为了进一步验证CmNPF7.3的功能，进行了西瓜毛状根的转基因实验。使用含有CmNPF7.3的pCAMBIA1300-CmNPF7.3载体通过根癌农杆菌K599介导的瞬时转化技术引入毛状根中。在盐处理一周后，VC株系的毛状根生长受到严重抑制，所有叶片均变黄并萎蔫，而OE株系的叶片仅在老叶中出现黄化，嫩叶仍保持绿色。Fv/Fm值在盐处理的VC株系中显著低于OE株系，表明OE株系的光合系统II功能受到的损害较小。此外，盐处理后，OE株系的H?O?和MDA含量显著低于VC株系，表明其抗氧化能力更强。SOD、POD和CAT的活性在OE株系中也显著高于VC株系，进一步证实了CmNPF7.3在提高抗氧化能力方面的关键作用。

为了研究CmNPF7.3对硝酸盐吸收的影响，测量了盐处理后西瓜毛状根和地上部的硝酸盐浓度。结果显示，盐处理组的根系硝酸盐浓度显著低于对照组，表明盐胁迫抑制了根系对硝酸盐的吸收。然而，在OE株系中，根系硝酸盐浓度显著高于VC株系，这表明CmNPF7.3的过表达增强了根系对硝酸盐的吸收能力，部分缓解了盐胁迫的影响。此外，盐处理后，OE株系的地上部硝酸盐浓度也显著高于VC株系，表明CmNPF7.3在促进地上部硝酸盐积累方面发挥了重要作用。

#### 5. 结论

本研究鉴定了西瓜基因组中的56个NPF家族成员，并将其分为八个亚家族。在这些NPF基因的启动子区域中发现了与植物激素信号和外部胁迫响应相关的多个顺式作用元件。其中，CmNPF7.3在耐盐表型的西瓜品种T103中受到盐胁迫的显著诱导，而在敏感品种T1中则被抑制。亚细胞定位分析表明，CmNPF7.3定位于质膜。CmNPF7.3的过表达显著提高了根系和地上部的硝酸盐浓度，增强了盐胁迫下的抗氧化能力和光合作用效率，并提高了植物的耐盐能力。本研究为理解西瓜NPF基因家族的耐盐调控机制提供了重要的线索，并为未来分子机制的验证和基因应用奠定了理论基础。