过氧亚硝酸盐激活的近红外荧光探针，用于急性肝衰竭的诊断和疗效评估

《Sensors and Actuators A: Physical》：Peroxynitrite-activated near-infrared fluorogenic probe for diagnosis and efficacy assessment in acute liver failure

急性肝衰竭（ALF）中过氧化硝基阴离子（ONOO?）的实时检测对诊断和治疗评估至关重要。本研究开发了一种COX-2靶向近红外荧光探针MB-COX，通过MB与吲哚美辛的耦合实现ONOO?的高灵敏度检测（限值0.1 μM）。在LPS/D-GalN诱导的ALF细胞和动物模型中，MB-COX动态监测ONOO?水平升高与NF-κB信号激活、iNOS及COX-2过表达的相关性，并证实二氢槲皮素（DHQ）通过抑制COX-2和减少ONOO?的产生发挥肝保护作用。该探针为ALF的实时病理机制解析和天然药物疗效评估提供了创新工具。

　　

刘梦月|彭伟|唐丹丹|叶碧山|翟瑞瑞|王飞|刘恒|余法彪|程子怡

中国海南省海口市海南医学院生命科学与医学技术学院，海南生物智能材料与生物医学设备工程研究中心，热带疾病控制国家重点实验室，海南功能材料与分子成像国家重点实验室，571199

摘要

急性肝衰竭（ALF）是一种进展迅速的疾病，具有高死亡率且缺乏有效的实时诊断工具。过氧亚硝酸盐（ONOO^-）通过一氧化氮（NO）和超氧阴离子（O₂^.-）之间的扩散控制反应生成，可诱导脂质过氧化和蛋白质硝化，与ALF的发病和进展密切相关。本文报道了一种针对COX-2的近红外荧光（NIRF）探针MB-COX。MB-COX通过将近红外发色团亚甲蓝（MB）与COX-2抑制剂吲哚美辛（INM）偶联制备而成。由于MB分子内的π共轭结构被破坏，MB-COX的背景荧光几乎可以忽略不计，在ONOO^-存在下其荧光会迅速恢复。MB-COX具有超低的检测限、优异的选择性和良好的响应性。利用MB-COX成功观察到了LPS/D-GalN诱导的ALF细胞模型中ONOO^-水平的升高，这一发现与NF-κB信号通路的激活以及iNOS、IL-6和COX-2的上调高度一致。此外，在ALF小鼠模型中，MB-COX能够精确实时可视化肝脏中的ONOO^-动态，并有助于评估天然黄酮类化合物二氢槲皮素（DHQ）的剂量依赖性护肝效果。总体而言，本研究确立了ONOO^-作为ALF潜在生物标志物的地位，并提供了一种实时、定量的化学工具，用于阐明病理机制、实现精准诊断和评估天然药物化合物的效果。

引言

急性肝衰竭（ALF）是一种由多种病因引起的急性临床综合征，包括感染、药物暴露、免疫缺陷和代谢紊乱[1]、[2]、[3]。其临床特征是发病突然且进展迅速，患者会在短时间内从轻度或无症状状态迅速发展为严重的肝功能障碍，表现为凝血障碍和肝性脑病[4]、[5]。在这些病因中，药物引起的肝毒性是ALF的主要诱因[6]。病理过程涉及多种相互关联的因素，如氧化应激、肝细胞解毒能力下降、全身炎症和循环系统紊乱。目前，ALF的临床诊断主要依赖于血清转氨酶、胆红素和凝血功能等常规指标[7]。然而，这些指标存在局限性，无法动态反映疾病进展和治疗效果。因此，迫切需要开发新的诊断工具。

氧化应激在ALF的分子发病机制中起着核心作用。在早期阶段，肝细胞内会发生炎症浸润和代谢功能障碍，同时诱导型一氧化氮合酶（iNOS）显著上调[8]、[9]。这导致一氧化氮（NO）过量产生。NO迅速与超氧阴离子（O₂^.-）反应生成过氧亚硝酸盐（ONOO^-[10]。ONOO^-通过硝化酪氨酸残基、诱导脂质过氧化和损伤线粒体DNA来加剧肝细胞损伤。环氧化酶-2（COX-2）是一种限速酶，在正常组织（如肝脏）中通常不存在，但在炎症期间显著上调，常伴随活性氧种类的积累。COX-2不仅是炎症的标志物，也是炎症性疾病的治疗靶点[11]。在ALF中，COX-2的表达与ONOO^-密切相关。ONOO^-上调COX-2的表达，进而增强ONOO^-的生成，形成正反馈循环，加剧氧化应激和炎症损伤[12]、[13]。因此，同时抑制COX-2活性和ONOO^-的生成被认为是一种有前景的治疗策略。

二氢槲皮素（DHQ）是一种具有显著抗氧化和抗炎特性的天然黄酮类化合物，据报道具有护肝作用[14]、[15]。目前对DHQ在ALF中的评估主要依赖于血清生物标志物和组织病理学分析，无法实现实时疗效监测。相比之下，近红外荧光（NIRF）探针具有高灵敏度、深组织穿透能力和低背景干扰等优点，能够实时可视化ALF相关的活性物种[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。尽管近年来开发了许多对ONOO^-敏感的NIRF探针，但其在ALF中的应用仍然相对有限[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。因此，设计一种针对COX-2的NIRF探针对于阐明DHQ的分子保护机制和评估其治疗效果具有重要意义。

在本研究中，通过将COX-2靶向基团与亚甲蓝（MB）核心偶联，合理设计并合成了NIRF探针MB-COX。在ONOO^-触发键断裂的情况下，MB-COX能够实现荧光激活，背景干扰极小。在LPS/D-GalN诱导的ALF细胞和小鼠模型中，MB-COX动态追踪了ONOO^-水平的病理变化，并可视化了DHQ的护肝效果。

材料与仪器

材料、仪器、光谱分析、细胞培养和成像、细胞模型以及ALF小鼠模型的详细信息见支持资料。

分子设计

亚甲蓝（MB）是一种经典的吩噻嗪染料，具有平面π共轭结构，赋予其出色的光稳定性和高摩尔消光系数。MB已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的临床造影剂批准[34]。其荧光发射位于近红外区域，低组织自荧光和高穿透深度使得体内成像的信噪比很高[35]、[36]。在本研究中，MB-COX是通过...

结论

总结来说，我们开发了一种用于检测ONOO^-的NIRF探针MB-COX，并成功将其应用于LPS/D-GalN诱导的ALF。MB-COX表现出近红外发射特性，对ONOO^-具有高选择性和敏感性。利用MB-COX，可视化了DHQ的治疗效果，证实了其减轻炎症反应和降低细胞内ONOO^-水平的能力。与传统生化标志物相比，MB-COX实现了ALF的直接可视化。

未引用的参考文献

[23]、[24]、[25]

CRediT作者贡献声明

叶碧山：验证。唐丹丹：撰写——初稿、验证、数据管理。彭伟：撰写——初稿、方法学、数据管理。刘梦月：撰写——初稿、方法学、数据管理。余法彪：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金获取。刘恒：审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。王飞：监督、资金获取。翟瑞瑞：验证。程子怡：撰写——审稿与

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22461020、22264013、82202647、82060461、82460553）、海南医学院学术提升支持计划（XSTS2025059、XSTS2025120、XSTS2025013）、海南省创新研究团队项目（820CXTD447）以及海南省临床医疗中心（2021）的支持。感谢海南医学院公共研究中心在仪器和设施方面提供的支持和帮助。

刘梦月是海南医学院的硕士研究生