分支式等离子体黑体纳米探针用于成像UVA照射下真皮成纤维细胞中的光老化信号分子

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Branched plasmonic blackbody Nanoprobes for Imaging Photoaging Signaling Molecules in UVA-Irradiated Dermal Fibroblasts

基于支链等离子体黑体（BPB）的荧光纳米探针成功实现了对UVA诱导真皮成纤维细胞（HDFs）中TGF-β1 mRNA、MMP-1 mRNA和COL1A1 mRNA表达变化的同步原位成像。该探针通过多色FRET淬灭机制，在BPB表面共价固定NH?-cDNA，并连接分别标记FAM、Cy3和Cy5的识别序列，实现精准的荧光恢复检测。研究揭示了光老化信号通路中这三个关键分子的动态调控关系，为开发新型抗光老化策略提供了技术支撑。

　　在现代生物医学研究中，理解细胞在外部环境刺激下的反应机制是揭示疾病发生发展规律和开发新型治疗策略的关键。本文介绍了一种基于分支等离子体黑体（branched plasmonic blackbody, BPB）的荧光纳米探针，该探针能够实现对人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblasts, HDFs）在UVA照射下，TGF-β1 mRNA、MMP-1 mRNA以及COL1A1 mRNA表达变化的同时原位成像。这种技术不仅提升了对皮肤光老化机制的理解，还为开发针对性的抗光老化策略提供了重要的工具支持。

皮肤老化是一个复杂的生物学过程，受到内在因素和外在因素的共同影响。内在因素包括遗传、自然老化等，而外在因素则主要涉及紫外线（UV）辐射。UV辐射被分为三个波段：UVA（320-400纳米）、UVB（280-320纳米）和UVC（100-280纳米）。UVC由于大气层中臭氧的强烈吸收，几乎无法到达地球表面，因此对皮肤老化的影响较小。UVB则主要作用于表皮层，能够引发皮肤炎症、红肿和晒伤等反应。相比之下，UVA具有更长的波长和较低的能量，可以穿透到真皮层，对胶原蛋白的降解和弹性纤维的破坏起到重要作用。UVA引起的光老化是目前皮肤老化研究中的重点之一，因为它与皮肤皱纹形成、弹性下降以及整体皮肤质地变化密切相关。

在光老化过程中，真皮成纤维细胞扮演着至关重要的角色。这些细胞是真皮层中最丰富的细胞类型，负责合成和分泌细胞外基质（extracellular matrix, ECM），对维持皮肤弹性、结构完整性和生理平衡具有重要作用。胶原蛋白，尤其是I型胶原蛋白，是ECM的重要组成部分，它不仅赋予皮肤强度和弹性，还影响皮肤的光泽、水分保持能力和机械张力。然而，过量的紫外线辐射会导致真皮层中I型胶原蛋白的含量显著减少，进而引发皮肤紧致度和水分含量的下降，最终导致光老化现象的出现。I型胶原蛋白的合成依赖于COL1A1基因的表达，而该基因的表达水平常被用作评估细胞光老化程度的重要指标。

除了胶原蛋白的合成减少，光老化还伴随着胶原蛋白降解的加速。这一过程主要由基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）介导，其中MMP-1是唯一能够直接降解完整胶原纤维的酶。紫外线照射会显著增加细胞内的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，而ROS的积累会激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路。该通路进一步激活转录因子AP-1，从而增强MMP-1的表达。因此，MMP-1 mRNA的表达水平也被视为评估细胞光老化程度的重要指标之一。

与此同时，转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）信号通路在光损伤中发挥着重要作用。TGF-β1是促进胶原蛋白合成的关键正向调节因子，而ECM的合成在体内主要通过TGF-β/Smad信号通路进行调控。然而，紫外线辐射会抑制TGF-β信号的传导，这种抑制作用主要表现为AP-1介导的TGF-β1 mRNA表达下调、下游Smad信号的受损以及COL1A1基因转录的抑制。此外，TGF-β1的表达减少还会削弱其对MMP-1表达的抑制作用，从而导致胶原蛋白合成减少和降解加速的双重效应，最终导致真皮层中I型胶原蛋白的净减少，成为皮肤光老化的重要原因。

为了更深入地研究这些信号通路的动态变化及其相互作用，传统的分子生物学技术虽然在一定程度上提供了有价值的信息，但其局限性也逐渐显现。这些方法通常需要复杂的实验步骤，耗费大量时间和资源，并且对生物信息学知识有较高的依赖性。因此，迫切需要一种更加便捷、高效且成本低廉的平台，以实现对细胞内信号通路的原位实时监测。荧光成像技术因其快速响应、高空间分辨率和原位可视化等优势，成为研究细胞内信号变化的理想工具。

荧光纳米探针作为一种高灵敏度、非侵入性的成像工具，已被广泛应用于细胞微环境监测、生物分子标记以及生物过程追踪等领域。其中，基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）原理设计的探针在生命科学和临床医学研究中展现出重要的应用价值。FRET的基本原理是：当两个荧光分子（供体和受体）之间的距离小于10纳米，并且供体的发射光谱与受体的吸收光谱存在显著重叠时，供体会通过非辐射的方式将能量传递给受体，使受体被激发并发出荧光。这种能量转移过程具有高度的特异性，能够有效区分目标分子与其他非目标分子的干扰，从而实现高灵敏度的检测。

然而，传统荧光探针的荧光淬灭效率往往不够理想，这会导致背景信号的增加和假阳性结果的出现。因此，开发具有广谱和高效淬灭能力的荧光淬灭剂成为构建高灵敏度FRET成像技术的关键。目前常用的荧光淬灭剂包括金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs）、银纳米颗粒（silver nanoparticles, AgNPs）、金属有机框架（metal-organic frameworks, MOFs）、聚多巴胺纳米颗粒（polydopamine nanoparticles, PDANPs）以及碳纳米管（carbon nanotubes, CNTs）。尽管这些材料在一定程度上能够实现对荧光信号的淬灭，但它们的吸收光谱往往难以与多种荧光分子的发射光谱产生有效的重叠，从而限制了对多个目标分子进行同步和多色检测的能力。这种局限性不仅影响了研究的效率，还增加了样本消耗和检测周期，提高了研究成本。

为了解决上述问题，本文开发了一种基于BPB的荧光纳米探针。BPB通过一种一步合成方法成功制备，其表面的聚多巴胺层富含醌基团，能够实现对氨基修饰的互补序列（NH?-cDNA）的稳定共价结合。随后，荧光标记的报告链（Cy3-rDNA、FAM-rDNA、Cy5-rDNA）通过碱基配对原则与互补序列进行杂交，最终构建出一种多色荧光纳米探针。该探针能够高效地淬灭多种具有不同激发/发射光谱的荧光分子（如FAM、Cy3、Cy5），从而实现对TGF-β1 mRNA、MMP-1 mRNA和COL1A1 mRNA的同时原位成像。这种技术不仅直观地揭示了三种关键信号分子在光老化通路中的时空动态变化，还为深入解析光老化分子机制以及开发针对性的抗光老化策略奠定了坚实的基础。

BPB纳米探针的设计和构建体现了对传统荧光淬灭材料的改进。其独特的结构和功能特性使其能够覆盖更广的光谱范围，并且在多种荧光分子的淬灭方面表现出更高的效率。这种广谱高效的淬灭能力使得BPB成为一种理想的探针材料，能够有效减少背景干扰，提高检测的准确性和可靠性。此外，BPB纳米探针的构建过程相对简单，便于大规模生产和应用，这进一步提升了其在实际研究和临床检测中的可行性。

在实际应用中，BPB纳米探针能够实时监测HDFs在UVA照射下，三种关键mRNA的表达变化。这种原位成像方法不仅能够提供细胞内分子动态变化的直观图像，还能够捕捉到不同时间点的信号变化，为研究光老化过程中的分子相互作用提供了新的视角。通过观察这些信号的变化，研究人员可以更准确地评估不同抗光老化策略的有效性，并探索新的治疗靶点。

BPB纳米探针的应用不仅局限于基础研究，还具有广阔的临床前景。例如，在抗光老化护肤品的开发过程中，该技术可以用于评估不同成分对细胞内信号通路的影响，从而优化配方设计。此外，在皮肤疾病的研究中，BPB纳米探针可以用于监测光损伤的分子机制，为疾病的早期诊断和治疗提供支持。在个性化医疗领域，该技术也有望用于评估个体对光老化干预措施的反应，实现更精准的治疗方案。

总之，本文所开发的基于BPB的荧光纳米探针为研究皮肤光老化提供了新的工具。该探针能够实现对三种关键mRNA的同时原位成像，揭示了光老化过程中复杂的分子机制。通过这种高灵敏度、高选择性和多色检测能力的技术平台，研究人员可以更全面地理解光老化过程中的信号变化，并为开发有效的抗光老化策略提供科学依据。未来，随着该技术的进一步优化和应用拓展，它有望在生物医学研究和临床实践中发挥更大的作用。