《Sensors and Actuators A: Physical》：Catalytic Hairpin Assembly (CHA)-driven AuNP Tetramer Assembly-based SERS Platform for Sensitive Detection of EV-miRNAs
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基于催化发夹组装的金纳米颗粒四聚体SERS平台实现了外泌体miRNA的高灵敏度检测，临床验证显示可有效区分胃癌患者与健康人群并评估癌变分期，联合检测三种miRNA诊断准确性优于单一标志物及传统生物标志物。
肖云军|范瑞|张克文|张雷|刘伟江|朱俊芳|邓阳曦|王伟莎|罗彦飞|罗世华|胡学娇
广东省人民医院（广东省医学科学院）临床实验室医学系，南方医科大学，广州，广东510080，中国
摘要
与细胞外囊泡相关的miRNA（EV-miRNAs）在肿瘤诊断中起着关键作用，并作为非侵入性生物标志物，在早期癌症检测和预后评估中具有广泛的应用潜力。然而，现有的EV-miRNA检测方法存在一些缺陷，如灵敏度不足、操作复杂和成本高昂，限制了其在临床诊断中的广泛应用。本研究提出了一种基于表面增强拉曼散射（SERS）技术的催化发夹组装驱动的金纳米粒子（AuNPs）四聚体平台，用于敏感检测EV来源的miRNAs。在目标miRNA存在的情况下，经过修饰的发夹结构会依次被激活并触发，最终形成金纳米粒子四聚体。这一过程释放出目标miRNA，使其能够进入下一个检测循环。随着AuNPs四聚体的形成，其表面的拉曼报告分子由于四聚体界面处的局部电场增强而产生增强的拉曼信号。该平台通过增强的SERS信号实现了超灵敏的miRNA检测，并能有效区分单碱基和双碱基错配的miRNA。临床验证结果表明，该平台能够有效区分胃癌（GC）患者和健康对照组，并在区分早期和晚期GC方面表现出色。此外，联合检测三种与GC相关的miRNA比单独检测miRNA或传统肿瘤生物标志物具有更高的诊断准确性。因此，该平台为EV-miRNA的高灵敏度检测提供了一种新的解决方案，具有广阔的临床应用前景。
引言
细胞外囊泡（EVs）是细胞释放到体液中的小囊泡，含有丰富的生物分子，如miRNA、mRNA和蛋白质[1]、[2]、[3]、[4]。这些分子反映了细胞的生理和病理状态，使EVs成为潜在的非侵入性生物标志物[5]，尤其在早期肿瘤诊断、预后评估和治疗监测中具有很高的价值[6]、[7]、[8]、[9]。由于EV来源的miRNAs（EV-miRNAs）具有很强的稳定性和易于从血液和尿液等体液中提取的特点，它们已成为肿瘤诊断和生物标志物发现研究的热点[10]、[11]、[12]、[13]。近年来，已经开发出了多种EV生物传感器，包括电化学、荧光、比色、化学发光和表面增强拉曼散射（SERS）技术[14]、[15]、[16]、[17]。在这些平台中，SERS技术作为一种有前景的EV-miRNA检测工具，在不同领域受到了特别关注，因为它具有低成本、易用、高灵敏度和高选择性等优点[18]、[19]、[20]。
开发具有高密度、均匀性和稳定性的SERS热点对于敏感检测EV-miRNAs至关重要[21]、[22]、[23]、[24]。通过调整纳米粒子上拉曼报告分子的组装方法、形态和分布密度，可以增强局部场强，有效补偿吸收分子的低拉曼截面[25]。DNA诱导的金纳米粒子（AuNPs）组装已被用于构建基于SERS的生物传感高有序结构[26]、[27]。Zhou及其同事使用定向自组装策略构建了金纳米粒子二聚体结构，开发出高灵敏度的SERS检测探针[28]。Li等人利用核酸序列自组装纳米结构，基于SERS开发了新型等离子体纳米材料用于生物分析[29]。然而，现有方法往往存在重复性差、纳米粒子分布控制不佳以及聚集结构不稳定等问题，这可能导致拉曼信号增强不一致。这些方法可能还需要复杂的制备过程和繁琐的优化。
催化发夹组装（CHA）是一种无需酶的核酸扩增技术，其中两个发夹DNA探针由目标DNA触发，从而启动级联扩增过程[30]、[31]、[32]。目标DNA催化发夹结构的打开，释放出链段，促进进一步组装，在等温条件下放大信号。在本研究中，我们提出了一种基于催化发夹组装（CHA）驱动的金纳米粒子（AuNPs）四聚体的SERS平台，用于检测EV来源的miRNAs。这种方法不仅提高了检测灵敏度，而且简单易用，能更好地控制聚集过程，确保拉曼信号放大的可靠性和一致性。通过精心设计四种不同的发夹DNA探针，并使用一步共冷冻方法将金纳米粒子与拉曼活性分子（DTNB）共功能化，我们实现了AuNP四聚体的程序化组装。该平台增强的SERS信号实现了EV-miRNAs的超灵敏检测。临床验证表明其在胃癌（GC）的早期诊断和临床分期方面具有优异的潜力。
材料与试剂
5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）购自Sigma–Aldrich（美国）。四水合氯金酸（HAuCl?·4H?O）和三钠柠檬酸二水合物（C?H?Na?O?·2H?O）购自上海药化试剂有限公司。磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）购自元叶生武（上海，中国）。TNaK缓冲液在pH 7.5下配制，含有20 mM Tris–HCl、125 mM NaCl和20 mM KCl。外泌体分离试剂（用于血浆或血清）购自RiboBio。
SERS平台的设计原理和检测策略
在本研究中，我们建立了一种基于催化发夹组装（CHA）的策略，用于定向组装金纳米粒子（AuNP）四聚体，以增强表面增强拉曼散射（SERS）并实现高灵敏度的miRNA检测。如图1所示，设计了四种发夹DNA探针（H1–H4），并与拉曼报告分子DTNB通过共冷冻方法分别结合，生成四种类型的发夹/DTNB共功能化AuNPs（HNTs-H1）。
结论
在本研究中，我们开发了一种基于CHA驱动的金纳米粒子（AuNP）四聚体组装的SERS平台，用于敏感检测EV来源的miRNAs。通过设计四种不同的发夹探针并将AuNP与拉曼活性分子共功能化，实现了AuNP四聚体的程序化组装。所得到的AuNP四聚体表现出优异的胶体稳定性和良好的有序结构，从而显著增强了SERS信号。该平台展示了出色的分析性能，包括
伦理声明和参与同意
本研究使用的所有临床血清均来自广东省人民医院，符合1964年《赫尔辛基宣言》中规定的机构伦理指南。该研究已获得广东省人民医院伦理委员会的批准（KY2023-214-01）。
CRediT作者贡献声明
王伟莎：方法学、研究。 罗世华：写作——审阅与编辑、数据管理、概念构思。 罗彦飞：资源获取、数据管理、概念构思。 肖云军：写作——初稿撰写、资金获取、概念构思。 胡学娇：写作——审阅与编辑、项目管理、概念构思。 张克文：方法学。 范瑞：数据分析、数据管理、概念构思。 刘伟江：软件开发、方法学。 张雷：验证、研究。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究由广东省医学研究基金（资助编号：B2025121）和广东省中医药科学研究项目（资助编号：20261002）资助。
肖云军于2020年获得重庆医科大学硕士学位。她目前在广东省人民医院（广东省医学科学院）临床实验室医学部门担任医师，主要从事病原微生物的快速诊断研究。
