通过LC-MS/MS技术，能够快速、灵敏且便捷地检测细胞内外的乳酸和丙酮酸浓度

《Talanta》：Rapid, sensitive and facile measurement of intra- and extracellular lactate and pyruvate in cells by LC-MS/MS

本研究开发并优化了一种LC-MS/MS方法，用于同时测定细胞内外的乳酸和丙酮酸浓度。该方法使用HILIC色谱柱，等度洗脱，总运行时间3.5分钟，检出限分别为1.78 μM和0.18 μM，验证显示其准确性和精密度符合要求。通过BEAS-2B和A549细胞模型验证，该方法灵敏度高、重现性好，适用于代谢调控研究和疾病诊断。

　　这项研究提出了一种优化的液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）方法，用于同时检测细胞内外的乳酸和丙酮酸。这两种代谢物在细胞功能中扮演着关键角色，尤其是在线粒体功能和细胞能量代谢方面。它们的浓度变化与多种疾病状态密切相关，例如癌症、炎症、心血管疾病等。因此，能够准确、快速地检测这两种代谢物的水平，对于理解细胞代谢变化及其在病理状态下的作用具有重要意义。

在实验中，研究团队使用了两种常用的呼吸道细胞模型：人支气管上皮细胞系BEAS-2B和人肺泡上皮细胞系A549。这些细胞被培养在24孔板中，这是一种广泛用于体外实验的格式，能够支持并行实验条件的测试，并减少试剂的使用量。传统的方法通常用于更大的培养皿，如6厘米培养皿或75平方厘米的培养瓶，这需要大量的细胞，且消耗较多的培养基。相比之下，24孔板格式更适合高通量实验，因此开发适用于该格式的检测方法具有重要价值。

研究团队优化了LC-MS/MS方法，以提高检测的效率和准确性。他们选择了基于亲水相互作用液相色谱（HILIC）的分离模式，使用了乙烷桥接的混合粒子填充柱（XBridge BEH柱），并采用了一种不含缓冲液的流动相，由乙腈和酸化的水组成（乙腈/水比例为60/40）。这种优化不仅提高了信号检测的灵敏度，还简化了实验流程，减少了实验中的干扰因素。此外，实验的运行时间被缩短至3.5分钟以内，比传统方法的24分钟显著减少，从而提高了检测效率。

在方法验证方面，研究团队采用了法国药学与技术科学学会（SFSTP）提出的标准。他们通过连续三天的实验，验证了方法的准确性和精密度。实验结果显示，该方法的日内和日间精密度均低于6.53%，而回收率在84.15%至102.85%之间，符合方法验证的要求。最低检测限（LLOQ）分别为1.78 μM（乳酸）和0.18 μM（丙酮酸），表明该方法在低浓度下的检测能力较强，适用于复杂样品中微量代谢物的分析。

乳酸和丙酮酸的提取过程分为细胞内和细胞外两部分。对于细胞外提取，研究团队从培养基中收集250 μL的样品，加入50/50的甲醇/水混合液进行提取，然后通过离心分离并保存于-80°C。而对于细胞内提取，细胞首先用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，以避免细胞外代谢物的干扰，随后加入50/50的甲醇/水混合液进行裂解，离心后收集上清液进行分析。实验还评估了不同提取溶剂对代谢物提取效率的影响，最终选择了甲醇/水混合液，因为它在提取效率和溶剂毒性之间取得了良好的平衡。

实验结果显示，乳酸和丙酮酸在细胞内外的浓度存在显著差异。在BEAS-2B细胞中，细胞内的乳酸和丙酮酸浓度分别为0.37 μM/μg蛋白质和0.012 μM/μg蛋白质，而细胞外的浓度则分别达到3962 μM/孔和93 μM/孔。这种差异反映了细胞内外代谢物的动态平衡，以及细胞膜上单羧酸转运蛋白（MCT1和MCT4）在调节代谢物交换中的作用。此外，实验还验证了该方法对代谢调节剂的响应能力，例如2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）和二甲双胍（metformin）。2-DG通过抑制糖酵解过程降低了乳酸的产生，而二甲双胍则通过影响线粒体功能，导致代谢路径向无氧糖酵解转移，从而增加乳酸水平。这些结果与现有文献一致，表明该方法能够有效检测代谢变化。

在A549细胞的实验中，研究团队同样应用了该方法，结果显示细胞内的乳酸和丙酮酸浓度高于BEAS-2B细胞，这可能与A549细胞作为癌细胞的代谢特征有关。癌细胞通常表现出类似Warburg效应的代谢模式，即使在有氧条件下也倾向于进行糖酵解并产生大量乳酸。因此，乳酸/丙酮酸比值（LPR）可以作为评估细胞代谢状态的一个重要指标，特别是在研究细胞对不同刺激或药物的反应时。

研究团队还评估了样品在不同储存条件下的稳定性，包括在室温下放置1至24小时、在-20°C和-80°C之间冻融1至10次，以及在4°C、-20°C和-80°C下储存一个月。结果显示，无论采用哪种储存方式，乳酸和丙酮酸的浓度均保持稳定，表明该方法在样品处理和储存过程中具有良好的可靠性。

该方法的开发和优化为研究细胞代谢提供了更加便捷、高效和准确的工具。它不仅适用于呼吸道细胞模型，还可以推广到其他类型的细胞，从而支持更广泛的研究需求。此外，该方法的低成本和高通量特性，使其在常规实验和大规模筛查中具有更大的应用潜力。通过这种方法，研究人员能够更深入地理解细胞代谢的变化，以及这些变化如何与疾病状态相关联，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和依据。