Punicalagin 通过激活 Nrf2/PGC-1α 通路和代谢重编程，提高了冷冻保存的绵羊精子的质量

《Theriogenology》：Punicalagin Enhances Cryopreserved Sheep Sperm Quality via Activation of the Nrf2/PGC-1α Pathway and Metabolic Reprogramming

本研究探讨 punicalagin 对冷冻保存羊精子的影响及分子机制，发现 15 μM punicalagin 可通过激活 Nrf2/PGC-1α 通路和代谢重编程（能量代谢、氧化平衡、膜保护）减轻冷冻损伤，显著提升精子活力和膜完整性，为改进羊精子冷冻技术提供新策略。

　　

孟康 Zhu|开远 Ji|金波 Wei|欣媛 Yuan|卢 Zhu|洪国 Cao|志军 Zhang|英辉 Ling

安徽农业大学动物科学技术学院，合肥 230036，安徽，中国

摘要

冷冻保存引起的损伤仍然是公羊精液保存的主要限制因素，尤其是会损害精子的运动能力和结构完整性。 Punicalagin 是一种具有强抗氧化特性的天然多酚，已被证明在缓解氧化应激方面具有潜力。然而，其在反刍动物精子冷冻保护中的作用尚未完全了解。本研究探讨了 punicalagin 对冷冻保存的绵羊精子的效果及其潜在的分子机制。在冷冻保存前后对冷冻损伤指标进行了全面评估。研究了不同浓度（0-20 μM）的 punicalagin 对精子运动能力、抗氧化途径和线粒体功能的影响。采用非靶向代谢组学方法分析了精子代谢物的变化，并使用选择性 Nrf2 抑制剂（ML385）验证了核心信号通路。冷冻保存显著降低了精子的运动能力、线粒体膜电位（ΔΨm, MMP）和三磷酸腺苷（ATP）水平，同时增加了尾部弯曲率和顶体缺陷（P < 0.05）。补充 punicalagin（15 μM）显著降低了活性氧（ROS）水平，增强了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，恢复了 ΔΨm，并下调了凋亡标志物（Bax/Fas）（P < 0.05）。Punicalagin 激活了 Nrf2/PGC-1α 通路，这一效应被 ML385 所抑制。代谢组学分析显示 punicalagin 调节了脂质代谢，并鉴定出五种差异代谢物，包括 20-COOH-10,11-二氢-LTB4、酰基肉碱 12:2、酰基肉碱 20:6、吡啶和十一酸，作为冷冻损伤评估的代谢生物标志物（AUC > 0.9）。这些发现表明，punicalagin 通过激活抗氧化途径和代谢重编程双重机制增强了精子的耐冻性，为改善反刍动物精液的冷冻保存提供了新的策略。

引言

精子冷冻保存是畜牧业和生物医学研究中的基本技术，支持长期遗传保存和优秀种群的利用 [1]。尽管牛冷冻精液已取得广泛商业成功，但由于解冻后精子运动能力显著下降 [2]，[3]，其在绵羊中的应用仍然有限。胆固醇与磷脂的比例以及磷脂中饱和脂肪酸的含量在决定耐冻性和膜流动性方面起着关键作用。公羊和公绵羊的胆固醇与磷脂比例相对较低，因此比兔子和人类更容易受到冷冻损伤。与新鲜精液相比，冷冻-解冻后的公绵羊精液运动能力（约 40-50%）和膜完整性显著下降 [2]，[3]。目前的公绵羊精液冷冻保存方法仍然不足，这是由于精子质膜的独特组成以及对冷冻过程中抗氧化防御机制理解不完全。

来自人类和家畜的大量证据表明，精子冷冻保存会减少活精子数量，并通过降低运动能力、线粒体活性、染色质完整性和受精潜力来损害精子功能 [4]，[5]。在冷冻过程中，精子会经历一系列复杂的物理化学损伤，包括冰晶形成、渗透压失衡和氧化应激。其中，由活性氧（ROS）引起的氧化应激是主要因素。精子中的 ROS 主要通过两条途径产生：一条涉及精子膜上的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶及其底物，另一条来自线粒体电子传递链中的电子泄漏，这是精子中 ROS 的主要来源 [4]，[6]，[7]。冷冻过程中的冰晶形成会损害细胞和线粒体膜，影响质膜完整性和线粒体功能。这些破坏干扰了 ROS 的稳态调节，导致 ROS 过度积累 [8]，[9]。此外，ROS 水平升高会诱导脂质过氧化和线粒体损伤，导致细胞内三磷酸腺苷（ATP）迅速耗尽，精子轴丝结构受损，以及运动能力和受精潜力下降 [3]，[7]，[11]。

Punicalagin（2,3-六羟基二苯氧基没食子酰-D-葡萄糖）是一种从石榴皮中提取的鞣花单宁，具有强自由基清除活性，这种活性归因于其没食子酰和六羟基二苯氧基结构 [12]，[13]。临床研究表明，punicalagin 具有多种生物活性，包括通过抑制 NF-κB/AMPK 通路激活发挥抗炎作用，以及通过激活 Nrf2/ARE 通路发挥抗氧化和线粒体保护作用 [14]，[15]，[16]。然而，punicalagin 在公羊精液冷冻保存中的潜在应用尚未得到探索，鉴于精液质膜组成和抗氧化需求的物种特异性差异，这是一个重要的研究空白。本研究通过计算机辅助精子分析（CASA）、基于荧光的活力和功能评估以及非靶向代谢组学，评估了 punicalagin 对解冻后公羊精液质量的剂量依赖性影响。目的是阐明 punicalagin 对冷冻损伤的保护机制，从而提高解冻后精液质量并改进冷冻公羊精液的制备方案。

部分摘要

伦理声明

所有涉及动物的实验程序均遵循动物福利指南进行，并获得了安徽农业大学动物护理委员会（编号 AHAU XMSQ2023065）的伦理批准。

动物和精液处理

使用人工阴道从六只健康的胡羊（Ovis aries）中收集精液样本，这些羊大约两岁，生殖能力已确认。每只公羊在10分钟间隔内采集两次精液，每周重复两次。

冷冻-解冻过程对精子质量参数的影响

冷冻-解冻过程显著损害了精子的运动能力和结构完整性。与新鲜样本相比，冷冻保存后具有渐进运动能力的精子比例和总运动能力显著降低（P < 0.05；图 1A-B）。此外，关键的运动参数也受到影响，包括平均路径速度（VAP）、直线速度（VSL）、曲线速度（VCL）、头部侧向位移幅度（ALH）、直线度（STR）、线性（LIN）、摇晃（WOB）等。

讨论

精子冷冻保存面临复杂的物理化学挑战，包括温度梯度、渗透压应激和 pH 值波动，这些因素共同破坏了细胞稳态并导致氧化损伤 [17]，[18]。研究表明，添加抗氧化剂可以通过清除自由基、维持氧化还原平衡和限制细胞内氧气耗竭来减轻冷冻引起的损伤 [19]。本研究表明，向冷冻保护剂中添加 15 μM 的 punicalagin

结论

本研究首次探讨了 punicalagin 与公羊精子中 Nrf2/PGC-1α 信号通路之间的潜在关联。结果表明，添加 15 μM 的 punicalagin 通过涉及能量代谢、氧化平衡和膜保护的三重代谢重编程机制显著改善了精子的冷冻保存效果。

CRediT 作者贡献声明

英辉 Ling：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目实施、资金获取、概念构思。志军 Zhang：监督、方法学、概念构思。欣媛 Yuan：可视化、方法学、研究、概念构思。金波 Wei：可视化、验证、监督、方法学、概念构思。洪国 Cao：监督、方法学、研究。卢 Zhu：可视化、验证、方法学、概念构思。开远 Ji：撰写

资金来源

本研究由中国农业研究系统（CARS-38）、安徽省重点研发计划（2023z04020003）和中国国家重点研发计划（2022YFD1300202）资助。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。