通过调节乙酰辅酶A的供应并减少在富集的紫色光合细菌培养物中的能量分流来提高H?的产量

《Water Research》：Enhance H 2 Production by Regulating Acetyl-CoA Supply and Reducing Equivalent Diversion in an Enriched Purple Phototrophic Bacteria Culture

短链挥发性脂肪酸（VFAs）混合喂养可提升紫色光养菌（PPB）产氢效率，其中丙酸与丁酸1:1混合时COD转化率达61%，显著高于单一丙酸（54%）。代谢分析表明，丁酸协同促进乙酰辅酶A（Ac-CoA）生成，激活三羧酸循环并抑制其他电子受体竞争，从而增强电子流向氢气合成。而丙酸与乙酸混合时，Ac-CoA主要驱动糖代谢途径，氢气产量未显著提高。研究揭示了混合VFAs通过Ac-CoA调控碳代谢与电子分配，为优化废水资源化产氢工艺提供理论依据。

　　短链挥发性脂肪酸（VFA）作为紫色光合细菌（PPB）生产生物氢气的碳源，因其高氢气转化潜力和低成本而备受关注。然而，目前大多数研究使用单一VFA作为碳源，这在实际应用中存在局限性，因为废水中的VFA通常以混合形式存在。此外，PPB对VFA混合物的代谢响应及其影响氢气产量的代谢机制仍不明确。本研究通过共培养丙酸与乙酸或丁酸，探讨其对PPB氢气生产的影响，并利用宏基因组和转录组分析揭示其相关的代谢响应。研究结果表明，当丙酸与丁酸按1:1的化学需氧量（COD）比例共培养时，底物转化效率达到61%，显著高于单独使用丙酸的54%。这种提升归因于丙酸与丁酸共同作用下乙酰辅酶A（Ac-CoA）的增加，一方面促进了三羧酸循环（TCA）的激活，增加了碳同化过程中的电子生成；另一方面降低了其他电子受体的竞争性，从而增强了电子向氢气的流动。相比之下，当丙酸与乙酸共培养时，转化效率约为50%，乙酰辅酶A的增加则主要通过乙醛酸途径促进碳同化。这些发现揭示了混合VFA对PPB代谢的协同作用，并突出了乙酰辅酶A在调控碳同化和电子耗散中的关键角色。理解这些相互作用对于选择适合的废水来源和预处理工艺至关重要，从而为PPB提供更有利的VFA组合，实现更高效和可持续的氢气生产。

全球能源需求的上升和环境问题的加剧使得氢气作为一种清洁能源备受关注。在生物制氢的多种途径中，基于紫色光合细菌（PPB）的光发酵技术因其在光照和厌氧条件下将有机物转化为生物氢气的能力而受到青睐，且具有较高的氢气产量（Capson-Tojo et al., 2020）。PPB的代谢效率受到多种因素的影响，包括碳源类型、氮源、光照条件、添加剂以及反应器设计等（Akhlaghi and Najafpour-Darzi, 2020; Zhang et al., 2021）。其中，碳源的选择是研究的重点，因为它与氢气产量和生产成本密切相关（Ghosh et al., 2017）。值得注意的是，短链挥发性脂肪酸（VFA）作为PPB的碳源，具有显著的吸引力，因其在生物制氢中的高效转化能力（Brown et al., 2022; Cheng et al., 2022）。然而，目前大多数关于碳代谢的研究仅限于单一碳源的分析（Cabecas Segura et al., 2021; Li et al., 2022）。实际上，废水中的VFA通常以混合形式存在，而非单独存在。因此，使用单一碳源的研究结果可能无法准确反映混合碳源的实际情况，因为多种VFA的共存可能会产生协同或拮抗效应。

在基于PPB的资源回收背景下，混合碳源已被用于研究其对碳同化、碳吸收速率、细菌生长、单细胞蛋白生产以及聚羟基烷酸酯（PHA）合成等方面的影响（De Meur et al., 2018; Peng et al., 2022; Cabecas Segura et al., 2021; Amini et al., 2025; Carvalho et al., 2025; Montiel-Corona et al., 2025）。然而，据我们所知，仅有少数研究探讨了混合VFA对PPB生物制氢的影响（Ren et al., 2008; Uyar et al., 2009; Carde?a et al., 2015, 2017; Han et al., 2012; Pattanamanee et al., 2012; Wu et al., 2010）。Uyar等人（2009）发现，当使用单一VFA作为碳源时，乙酸、丙酸和丁酸的底物转化效率分别为33%、31%和14%。有趣的是，当这些VFA混合使用时，转化效率提升至35%-47%，明显优于单一底物的情况。同样，Ren等人（2008）观察到，在乙酸喂养的基础上添加丁酸可以提高氢气的生产速率。然而，引入混合碳源也可能导致底物吸收偏好和分解抑制。Uyar等人（2009）指出，PPB在不同母反应器的碳源条件下，总是优先吸收乙酸，随后是丙酸，最后是丁酸。这一现象值得重视，因为易吸收的碳源可能会抑制具有更高氢气生成潜力的底物的吸收。

以往的研究主要评估了PPB在不同碳源下的生长和氢气生产性能，但缺乏代谢层面的机制性洞察，这限制了其研究结果在更广泛场景中的应用。在我们之前的研究（Huang et al., 2025）中，我们发现丙酸在氢气产量方面优于乙酸和丁酸，并且宏基因组分析进一步表明，乙酰辅酶A的可用性可能在引导电子流动和影响氢气产量方面发挥关键作用。在混合VFA的条件下，乙酰辅酶A的可用性与单一碳源条件下的情况不同。Cabecas Segura等人（2021）指出，丙酸和丁酸的共同利用能够增强乙酰辅酶A的生物合成，因为丁酰辅酶A比甲基丙二酰辅酶A途径更高效地产生乙酰辅酶A，这可能解释了在混合碳源条件下，Rhodospirillum rubrum的生长速度比单独使用丙酸时更快。此外，Fradinho等人（2014）发现，当添加乙酸时，丙酸的消耗显著增加，这可能是由于乙酸提高了细胞内的乙酰辅酶A水平，从而增强了整体代谢效率。这些发现表明，丙酸与乙酸或丁酸的共培养能够提升乙酰辅酶A的可用性，进而促进底物吸收和细胞生长。然而，乙酰辅酶A的增加如何改变电子耗散途径并影响氢气产量仍不明确。因此，研究丙酸与乙酸或丁酸共培养对PPB代谢的影响，对于理解混合VFA对生物制氢的潜在影响具有重要意义。

本研究旨在探讨混合VFA——特别是丙酸与乙酸或丁酸共培养——对PPB生物制氢的影响，并通过宏基因组和转录组分析揭示PPB在这一过程中的代谢途径适应。研究的主要目标包括：（i）评估在丙酸单独或与乙酸、丁酸共培养条件下，PPB富集培养物的生长和氢气生产性能；（ii）识别细胞内的化合物，并表征在高效和可持续氢气生产阶段，还原力向各种光合产物的分配情况；（iii）阐明PPB在混合VFA同化过程中的优选代谢途径以及还原当量的分配机制。通过这些研究，我们希望揭示混合VFA对PPB代谢的潜在影响，并为未来在废水处理和生物制氢领域中优化VFA的组合提供理论依据和实践指导。

在实验过程中，我们使用了一个实验室规模的PPB反应器，其操作流程参考了Huang等人（2024）的研究，并作为后续分批培养实验的种子培养物。母反应器的培养基配方为每升包含1.2克丙酸钠、0.6克KH?PO?、0.9克K?HPO?、0.4克NH?Cl、0.2克MgSO?·7H?O、0.02克CaCl?·2H?O、1毫升微量元素溶液和1毫升维生素溶液。母反应器在连续搅拌釜式反应器（CSTR）模式下运行，以确保稳定的微生物群落和代谢状态。随后，我们进行了分批培养实验，以评估不同VFA混合比例对PPB代谢和氢气生产的影响。

实验周期为80天，分为两个阶段：适应阶段（第0至40天）和稳定阶段（第40至80天）。在稳定阶段，PPB的生长动力学和氢气生产性能得到了总结，并在图1中进行了可视化展示。如图1（c）和图1（d）所示，化学需氧量（COD）的显著波动反映了PPB在不同VFA混合条件下的代谢适应性。在适应阶段，微生物群落需要时间来调整其代谢策略，以适应新的碳源环境。而到了稳定阶段，PPB已经建立了稳定的代谢路径，能够高效地利用混合VFA进行氢气生产。在这一阶段，我们观察到丙酸与丁酸共培养时，底物转化效率达到61%，显著高于单独使用丙酸的54%。这一结果表明，丙酸与丁酸的共培养能够有效提升PPB的代谢效率，进而提高氢气产量。

相比之下，当丙酸与乙酸共培养时，底物转化效率约为50%。这一效率虽然略低于丙酸与丁酸共培养的情况，但仍然高于单独使用丙酸的效率。研究发现，乙酸的加入通过乙醛酸途径促进了丙酸的同化，这可能与乙酸提高了细胞内的乙酰辅酶A水平有关。乙醛酸途径是一种重要的代谢途径，能够在不完全氧化碳源的情况下，将乙酸转化为乙酰辅酶A，从而支持PPB的生长和氢气生产。因此，乙酸与丙酸的共培养可能通过激活乙醛酸途径，提高碳源的利用效率，并增强PPB的代谢能力。

此外，我们还发现，不同VFA混合比例对氢气产量有显著影响。例如，Carde?a等人（2015, 2017）的研究表明，改变混合VFA的喂养比例会导致氢气产量的显著变化。这提示我们，在实际应用中，选择合适的VFA混合比例对于最大化氢气产量至关重要。不同废水来源可能含有不同种类和浓度的短链VFA，因此，针对不同废水的VFA组成进行优化，是提高PPB生物制氢效率的关键。通过本研究，我们希望揭示混合VFA对PPB代谢的具体影响，并为未来在废水处理和生物制氢领域中优化VFA组合提供科学依据。

为了更深入地理解PPB在混合VFA条件下的代谢适应，我们采用了宏基因组和转录组分析技术。宏基因组分析能够提供微生物群落的基因组成信息，而转录组分析则可以揭示这些基因在特定条件下的表达情况。通过这两种分析手段，我们能够识别PPB在混合VFA条件下的关键代谢基因，并进一步探讨其表达模式如何影响氢气的生产。研究发现，丙酸与丁酸共培养时，PPB的代谢途径发生了显著的适应性变化，这可能与乙酰辅酶A的增加有关。乙酰辅酶A的增加不仅促进了三羧酸循环的激活，还可能通过减少其他电子受体的竞争性，增强了电子向氢气的流动。此外，丙酸与乙酸共培养时，PPB的代谢途径也发生了变化，这可能与乙醛酸途径的激活有关。乙醛酸途径的激活有助于提高碳源的利用效率，并支持PPB的生长和氢气生产。

通过这些研究，我们发现混合VFA对PPB的代谢具有重要的调控作用。乙酰辅酶A的可用性在这一过程中起到了关键作用，不仅影响了碳源的同化效率，还可能通过改变电子耗散途径，影响氢气的产量。因此，理解混合VFA对PPB代谢的影响，对于优化生物制氢工艺和提高其可持续性具有重要意义。未来的研究可以进一步探讨不同VFA混合比例对PPB代谢的具体影响，并结合宏基因组和转录组分析，揭示其背后的分子机制。此外，还可以研究不同废水来源中VFA的组成和浓度如何影响PPB的代谢效率，并探索相应的预处理工艺，以提高VFA的可用性和PPB的代谢能力。

总之，本研究通过实验和分析，揭示了混合VFA对PPB生物制氢的影响，并探讨了其背后的代谢机制。丙酸与丁酸共培养时，PPB的代谢效率显著提高，这可能与乙酰辅酶A的增加有关。乙酰辅酶A的增加不仅激活了三羧酸循环，还可能通过减少其他电子受体的竞争性，增强了电子向氢气的流动。相比之下，丙酸与乙酸共培养时，乙醛酸途径的激活可能对碳源的利用效率产生了重要影响。这些发现表明，混合VFA能够通过不同的代谢途径，影响PPB的生长和氢气生产。因此，选择合适的VFA混合比例，对于提高生物制氢的效率和可持续性至关重要。未来的研究可以进一步探讨混合VFA对PPB代谢的具体影响，并结合宏基因组和转录组分析，揭示其背后的分子机制。此外，还可以研究不同废水来源中VFA的组成和浓度如何影响PPB的代谢效率，并探索相应的预处理工艺，以提高VFA的可用性和PPB的代谢能力。