半胱氨酸S-乙酰化：代谢调控中一种广泛存在且动态响应的新型蛋白质翻译后修饰

《npj Metabolic Health and Disease》：Cysteine S-acetylation is a widespread post-translational modification on metabolic proteins

本研究针对短链半胱氨酸酰化修饰因硫酯键不稳定性而长期难以检测的问题，开发了能保存硫酯键的蛋白质组学样品制备方法，在小鼠肝脏中系统性鉴定了超过400个半胱氨酸S-乙酰化位点，其丰度与赖氨酸乙酰化相当。研究发现该修饰广泛存在于代谢酶上，具有组织特异性和亚细胞区室分布特征，并能响应冷暴露等生理刺激动态重塑。功能实验证实GAPDH Cys150位点的乙酰化会使其酶活丧失并促进其核转位。该发现将蛋白质乙酰化的范畴从赖氨酸拓展至半胱氨酸，为理解乙酰辅酶A可用性如何直接调控蛋白质功能提供了新机制。

　　

在生命活动的精密调控网络中，蛋白质翻译后修饰扮演着核心角色。它如同给蛋白质贴上各式各样的“化学标签”，极大地扩展了基因组编码的蛋白质功能多样性。在已知的500多种修饰中，发生在赖氨酸上的乙酰化是研究最为深入的修饰之一，它从最初发现于组蛋白并调控基因表达，逐渐被认识到在细胞各处广泛存在，并与细胞代谢状态紧密关联。然而，科学界对蛋白质乙酰化的认知长期局限于赖氨酸残基。半胱氨酸，凭借其侧链巯基独特的化学反应活性，是多种重要翻译后修饰的靶点，如S-硝基化、S-棕榈酰化等，但短链的酰化修饰（如乙酰化）是否同样存在于半胱氨酸上，却一直是个未解之谜。这并非因为其生物学上不重要，而是由于连接酰基与半胱氨酸的硫酯键非常不稳定，在常规蛋白质组学样品制备过程中极易被破坏，导致这一潜在的修饰“暗物质”难以被探测到。

为了揭开这一隐藏的修饰景观，发表在《npj Metabolic Health and Disease》上的研究开发了一套创新的样品制备策略，成功地在小鼠体内鉴定并表征了广泛存在的半胱氨酸S-乙酰化。研究人员意识到，标准方法中使用的还原剂二硫苏糖醇会破坏硫酯键，而中性或碱性pH会加速其水解。因此，他们改用三(2-羧乙基)膦作为还原剂，将样品pH严格控制在7.0以下，并在组织裂解后立即进行烷基化封闭，以阻止乙酰基在游离半胱氨酸之间的转移，从而最大程度地保存了天然的半胱氨酸乙酰化状态。

关键技术方法概述

本研究的关键技术在于优化了用于质谱分析的蛋白质组学样品制备流程，核心是保护不稳定的半胱氨酸乙酰化修饰。研究人员使用TCEP替代DTT作为还原剂，维持样品pH在6.5-7.0，并采用快速烷基化策略。通过对小鼠多种组织（包括肝脏、棕色脂肪等）进行蛋白质提取和酶解，利用液相色谱-串联质谱进行非标记定量分析，并通过生物信息学方法鉴定修饰位点、进行差异分析和通路富集分析。此外，还通过亚细胞分级分离技术分析修饰的区室化分布，并利用体外酶活实验验证特定修饰的功能效应。

研究结果

半胱氨酸S-乙酰化的鉴定与确认

通过优化的质谱分析方法，研究团队在小鼠肝脏蛋白质组中鉴定出463个含有半胱氨酸侧链乙酰化（质量增加+42.011 Da）的肽段，占所鉴定到的半胱氨酸肽段的8.4%。与此相比，在同一批样品中仅鉴定到384个赖氨酸乙酰化肽段，表明半胱氨酸乙酰组的规模与赖氨酸乙酰组相当。为了确认该修饰的化学本质是硫酯键，他们比较了分别用TCEP和DTT处理样品的结果。DTT处理导致89%的显著变化的乙酰化半胱氨酸肽段信号降低，证实了其对硫酯键的切割作用，从而强有力地证明了所检测到的确实是半胱氨酸S-乙酰化。

通路富集分析显示，半胱氨酸乙酰化蛋白质显著富集于代谢相关通路，如细胞氨基酸分解代谢过程、脂肪酸β-氧化等。高丰度的乙酰化蛋白包括过氧化氢酶、胰腺甘油三酯脂肪酶、谷胱甘肽S-转移酶以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶等关键代谢酶，提示半胱氨酸S-乙酰化是一种在体内发生且富集于代谢蛋白的修饰。

乙酰辅酶A是半胱氨酸乙酰化的酰基供体

为了探究乙酰基的来源，研究人员用不同浓度的乙酰辅酶A处理小鼠肝脏裂解液。结果发现，乙酰辅酶A处理能以浓度依赖的方式显著增加半胱氨酸乙酰化的总体水平和鉴定到的位点数量。1 mM乙酰辅酶A（生理浓度）主要增加了已有位点的乙酰化程度，而10 mM乙酰辅酶A（超生理浓度）则能乙酰化更多新的半胱氨酸位点。不同位点对乙酰辅酶A的响应模式各异，有的呈饱和型（如过氧化氢酶Cys393），有的呈线性增长型（如谷氨酸脱氢酶Cys112），有的则呈阈值型（如GAPDH Cys150），这表明半胱氨酸乙酰化具有高度的位点特异性，并可能受到局部微环境、半胱氨酸反应活性及蛋白质构象等多种因素调控。

半胱氨酸乙酰组的亚细胞分布

通过亚细胞分级分离，研究发现半胱氨酸乙酰化在胞质组分中水平最高，而在含有线粒体和细胞核的重膜组分中水平相对较低。这一分布模式与赖氨酸乙酰化（常富集于乙酰辅酶A浓度较高的线粒体）形成鲜明对比。主成分分析表明，不同亚细胞区室（胞质、轻膜、重膜）的半胱氨酸乙酰化模式存在明显差异，仅有约22%的位点在三个区室中共享，提示该修饰可能具有区室特异性的功能。每个区室中乙酰化蛋白所富集的通路也与该区室已知的生物学功能相符，例如重膜组分中氧化磷酸化通路富集。

小鼠多种器官中组织特异性的半胱氨酸乙酰化模式

对九种小鼠组织（棕色脂肪组织、脑、心、肾、肝、肺、胰腺、骨骼肌和脾）的调查揭示了显著的组织特异性乙酰化模式。每种组织都具有独特的乙酰组特征，主成分分析能清晰地将不同组织区分开来，其中脑、骨骼肌和心脏的分离程度最大。胰腺显示出最高的半胱氨酸乙酰化标准化丰度，而骨骼肌最低。除了组织特异性修饰外，也发现了一些普遍存在的修饰，如核糖体蛋白RPL4在所有九种组织中均被乙酰化，表明对翻译机器的修饰可能是一种保守现象。

冷诱导产热过程中半胱氨酸乙酰组的动态调控

为了探究半胱氨酸乙酰化是否能响应生理刺激，研究人员比较了室温饲养和6°C冷适应4周小鼠的棕色脂肪组织。虽然总乙酰化水平没有显著变化，但冷暴露诱导了半胱氨酸乙酰组的显著重组。主成分分析显示，两种条件能沿第一主成分（解释65.6%的方差）清晰分离。基因集富集分析表明，在冷适应小鼠的乙酰组中，脂肪生成、脂肪酸代谢和氧化磷酸化通路显著富集。特别值得注意的是，GAPDH活性位点（K143和C150）的乙酰化在冷暴露后显著增加。

半胱氨酸乙酰化抑制GAPDH催化活性

对GAPDH的深入研究揭示了其催化活性位点Cys150是半胱氨酸乙酰化的靶点。体外实验表明，随着乙酰辅酶A孵育时间的延长，GAPDH活性位点的乙酰化程度增加，而其催化活性相应降低，孵育24小时后活性丧失约90%。这证实了Cys150的乙酰化会废除GAPDH的酶功能。

乙酰化的GAPDH亚型富集于核组分

进一步分析亚细胞分级数据发现，一个次要的GAPDH亚型（S4R1W1，与经典亚型差异在于A156S替换）表现出独特的性质：其活性位点在所有数据集中均被组成型乙酰化，并且主要定位于富含细胞核的重膜组分。而在经典亚型中，活性位点乙酰化水平较低且多变。这种组成型修饰和独特的定位提示，S4R1W1可能代表了一个专门执行非糖酵解功能的GAPDH形式。

研究结论与意义

这项研究颠覆性地发现了半胱氨酸S-乙酰化是一种在哺乳动物组织中广泛存在、丰度可与赖氨酸乙酰化媲美的蛋白质翻译后修饰。此前其未被发现主要源于技术限制，而非生物学上的不存在。该修饰具有组织特异性、亚细胞区室化分布，并能响应乙酰辅酶A水平和生理刺激（如冷暴露）发生动态重塑。对GAPDH的案例研究证明，半胱氨酸乙酰化能够直接调控酶活性，并可能影响其亚细胞定位，其功能效应与已知的S-硝基化等修饰有相似之处。

这一发现极大地扩展了人们对蛋白质乙酰化景观的认识，将修饰的范畴从赖氨酸拓展至半胱氨酸。半胱氨酸乙酰化作为一种潜在的代谢传感器，能够直接将细胞内乙酰辅酶A的可用性与蛋白质功能调控联系起来。由于其硫酯键易于水解或酶促去乙酰化，该修饰可能提供一种快速、可逆的机制，用于精细调控代谢酶活性，从而响应代谢状态的变化。该研究为理解细胞如何通过多种半胱氨酸修饰（乙酰化、硝基化、琥珀酸化等）来微调像GAPDH这样的多功能蛋白质的活性平衡提供了新的视角。未来，开发特异性检测和富集乙酰化半胱氨酸的工具，以及利用代谢示踪等技术，将有助于更深入地揭示这一新修饰在生理和病理条件下的具体功能与调控机制。