野生蜂Ceratina calcarata候选内参基因的发育和环境稳定性研究及其在传粉生物学中的应用

《Scientific Reports》：Developmental and environmental stability of candidate reference genes in the wild bee ceratina calcarata

本研究针对野生小木蜂Ceratina calcarata在基因表达研究中缺乏稳定内参基因的问题，通过评估7个候选内参基因（RPS18、RPS5、RPL32、RPL8、EF-1α、β-Actin和GAPDH）在不同发育阶段（幼虫、蛹、成虫）和景观环境（常规农场、有机农场、路边）下的表达稳定性。采用四种算法（GeNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt法）综合分析发现RPS18和RPL8为最稳定内参基因。该研究为首个在C. calcarata中验证的内参基因集，为传粉昆虫生物学研究提供了重要技术基础。

　　

在全球生态系统中，传粉昆虫的服务不可或缺——约87.5%的开花植物依赖动物传粉，75%的农作物通过传粉提高35%的产量。然而，近年来野生蜂种群数量急剧下降，这主要源于栖息地丧失、农药使用、景观改变和寄生虫等因素。小木蜂Ceratina calcarata作为北美东部本土的重要传粉昆虫，不仅具有生态和经济价值，还表现出亚社会性行为（如延长母性照顾和母女互动），是研究社会性进化的理想模型。

尽管已有研究对C. calcarata进行了基因组和转录组测序，但在基因表达分析中，实时定量逆转录聚合酶链式反应（q-RT-PCR）的准确性严重依赖稳定的内参基因。然而，该物种缺乏经过验证的内参基因，使得基因表达研究面临挑战。为此，研究人员首次系统评估了7个常用内参基因在C. calcarata中的表达稳定性。

研究团队于2024年春季在俄亥俄州西部采集样本，涵盖三种景观类型：使用农药的常规农场、使用天然农药的有机农场以及无农业活动的路边环境。通过将直径超过7毫米的树莓茎秆固定在竹签上插入地下，成功吸引C. calcarata筑巢。采集后，通过视觉鉴定将样本分为幼虫（大型幼虫，可能为4龄或5龄）、蛹和成虫阶段。使用TRIzol法提取总RNA，并通过DNase I去除基因组DNA。随后，研究人员根据C. calcarata基因组注释设计引物，确保扩增子长度为90-130 bp，并跨外显子连接处以避免基因组DNA扩增。通过逆转录PCR和熔解曲线验证引物特异性，并使用cDNA系列稀释测定引物效率（91.05%至108.40%）。q-RT-PCR反应使用SYBR Green Mix进行，每个样本设三个技术重复。

表达水平分析

结果显示，候选内参基因的Ct值范围在14.83至32.01之间。在不同发育阶段和采集地点中，RPS18和RPL8的Ct值变异较小，而GADPH和ACT波动较大。

ΔCt法分析

通过计算Ct值的标准差评估基因稳定性。在幼虫和成虫阶段，RPL8均为最稳定基因。在景观分析中，有机、路边和常规地点的最稳定基因分别为RPS18、RPS5和RPL32。

geNorm分析

该算法通过平均配对变异计算稳定性值（M值），值越低越稳定。幼虫阶段中，RPL8和RPL32最稳定；成虫阶段中，RPS18和RPL8最稳定。景观分析显示，有机、路边和常规地点的最稳定基因分别为RPS18、RPS5和RPL8。

BestKeeper分析

基于变异系数（CV）和标准差（SD）评估稳定性。幼虫阶段中，ACT和RPS18最稳定；成虫阶段中，RPS18和RPL8最稳定。景观分析中，有机、路边和常规地点的最稳定基因对分别为RPL32/RPS18、RPS18/RPS5和ACT/RPS18。

NormFinder分析

该算法通过稳定性值（值越低越稳定）识别最佳内参基因。结果显示，RPS18和RPL32在不同发育阶段和景观中均表现稳定。

RefFinder整合分析

综合四种算法结果，RefFinder确定RPS18和RPL8在幼虫和成虫阶段均为最稳定基因。景观分析中，RPS18在有机地点与EF-1α、在路边地点与RPS5、在常规地点与RPL8共同成为最稳定基因对。

本研究首次在C. calcarata中系统验证内参基因，发现基因稳定性受发育阶段和环境影响。研究结果与另一种独居蜂Megachile rotundata的报道一致，进一步证实RPS18和RPL8的普适性。这些内参基因的确定为未来研究C. calcarata在发育、行为、环境适应等方面的基因表达提供了可靠工具，对传粉昆虫保护生物学具有重要意义。