一种适用于肝细胞癌循环肿瘤细胞胞内与表面标志物同步检测的固定兼容性流式方案

《Scientific Reports》：A fixation-compatible protocol for intracellular and surface marker-based detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma

本研究针对肝细胞癌（HCC）循环肿瘤细胞（CTC）检测中因EpCAM表达异质性导致的漏检难题，开发了一种基于固定处理的流式细胞术方案。通过系统评估固定条件对胞内标志物（如PanCK）与表面标志物（EpCAM、CD45）检测的影响，研究证实固定样本在保持表面表位完整性的同时，可实现高效的胞内染色，且细胞回收率仅降低7-10%。临床验证中，该方案成功从HCC患者血液中检出CTC，并在CTC来源DNA中检测到肿瘤特异性CTNNB1突变，为HCC液体活检提供了标准化、可存储的实用技术路径。

　　

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球第六大高发癌症和第三大癌症相关死亡原因，其早期诊断和动态监测一直面临巨大挑战。目前临床常用的生物标志物甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP）灵敏度仅为40%-60%，且仅能提供间接的肿瘤存在证据。液体活检技术通过检测血液中的循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）或肿瘤来源的核酸分子，为肿瘤的无创监测带来了新希望。然而，CTC检测在HCC中的应用仍受到细胞稀有性和表面标志物表达不稳定的限制。例如，上皮细胞黏附分子（EpCAM）在HCC的CTC中表达率仅约35%，且易因上皮-间质转化（Epithelial-to-Mesenchymal Transition, EMT）而下调或丢失。细胞角蛋白（Cytokeratin, PanCK）作为稳定的上皮标志物虽具潜力，但其胞内定位需通过固定和透化步骤才能被流式细胞术检测，而传统方法因担心固定导致细胞损失和表面表位损伤而避免使用此类操作。此外，现有CTC分析多依赖新鲜样本的即时处理，难以满足临床大样本量和高通量检测的需求。

为解决上述问题，约翰斯·霍普金斯大学等机构的研究团队在《Scientific Reports》上发表论文，提出了一种适用于HCC的CTC固定兼容性流式检测方案。该研究通过系统比较不同样本处理方式（新鲜、冻存、固定后冻存、固定未冻存）对HepG2细胞和外周血单核细胞（PBMCs）中PanCK、EpCAM和CD45表达的影响，评估了固定处理对胞内与表面标志物同步检测的可行性。关键技术方法包括：流式细胞术分析、荧光激活细胞分选（FACS）、CD45阴性富集、液滴数字PCR（ddPCR）突变检测，并利用HCC患者外周血样本进行临床验证。

结果

固定实现胞内染色且不损害表面标志物完整性

通过比较固定/透化与未固定处理的HepG2细胞和PBMCs，研究发现固定处理可显著提升PanCK的检测信号，而未固定细胞即使提高抗体浓度也无法检测到PanCK表达。

同时，EpCAM和CD45的表面标志物染色在固定后仍保持稳定，表明固定处理在实现胞内蛋白检测的同时未破坏表面表位。

同步染色法与传统序列染色法效果相当

研究对比了传统三步序列染色法（表面染色、固定透化、胞内染色）与两步同步染色法（先固定，后同步进行表面与胞内标志物染色）。

结果显示，同步染色法仅导致CD45阴性率轻微下降（98.96% vs. 99.86%），但CTC检出率无显著差异，且EpCAM的平均荧光强度（MFI）更高，表明该方法在减少洗涤步骤和细胞损失的同时提升了检测效率。

固定未冻存样本与新鲜样本性能相近

通过比较四种样本处理方式（新鲜、冻存、固定后冻存、固定未冻存）的染色效果，研究发现固定未冻存样本在PanCK阳性率、EpCAM阳性率及CTC检出率方面均与新鲜样本无显著差异。

而传统冻存样本则出现EpCAM染色指数下降和假阳性CD45染色，表明固定前处理对维持细胞完整性更优。

固定样本在4°C下可稳定存储四周

将固定未冻存样本在4°C下存储一至四周后分析，其PanCK与EpCAM的MFI及CTC检出率均无显著变化，但四周后自发荧光背景有升高趋势，提示长期存储需谨慎。

固定样本细胞回收率接近新鲜样本

通过向PBMCs中梯度接种HepG2细胞（50-1000个），比较四种处理方式的细胞回收率。

结果显示，固定样本（无论冻存与否）的回收率仅比新鲜样本低7%-10%，而传统冻存样本回收率显著降低（平均23.67% vs. 44.71%），证实固定处理在保证检测灵敏度方面的优势。

固定样本方案在HCC患者CTC检测中的验证

在10例HCC患者血样中，通过CD45阴性富集后固定处理，所有样本均成功检出CTC（平均9个/5 ml血液）。其中两例患者的CTC来源DNA中检测到CTNNB1基因突变（密码子32-37及41-45），而对应血浆循环游离DNA（cfDNA）中未检出该突变，凸显了CTC在提供肿瘤特异性基因信息方面的独特价值。

结论与讨论

本研究建立的固定兼容性流式方案成功解决了HCC的CTC检测中因EpCAM表达异质性导致的漏检问题，通过同步染色策略实现了胞内与表面标志物的高效检测。固定未冻存样本在4°C下可稳定存储四周，且细胞回收率损失微小（<10%），为临床大样本批量化处理提供了技术基础。尤其值得注意的是，CTC来源DNA中检测到的CTNNB1突变未被血浆cfDNA捕获，提示固定CTC在基因组分析中具有独特优势。尽管当前验证仅基于HepG2细胞和有限临床样本，但该方案为HCC及其他实体瘤的液体活检提供了标准化、可扩展的技术路径，有望推动CTC从研究工具向临床标志物的转化。