多模态空间组学揭示肺泡祖细胞与促炎微环境在肺腺癌前病变演进中的协同演化

《Cancer Cell》：Multimodal spatial-omics reveal co-evolution of alveolar progenitors and proinflammatory niches in progression of lung precursor lesions

本研究通过单细胞与空间转录组学分析，揭示了肺泡祖细胞（KRT8+ KACs）作为肺腺癌（LUAD）最早前体细胞，定位于富含IL-1β–IL1R1信号的促炎微环境中。研究发现上皮-促炎微环境在癌前病变中更为常见，靶向IL-1β联合PD-1阻断可在小鼠模型中有效减少肺泡祖细胞并抑制LUAD发生，为肺癌早期拦截提供了新策略。

　　

肺腺癌（LUAD）是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，尤其在吸烟和非吸烟人群中的发病率持续上升。尽管近年来靶向治疗和免疫治疗取得了显著进展，但晚期LUAD患者的预后仍然较差。究其原因，很大程度上源于我们对LUAD从癌前病变向侵袭性癌演进的分子和细胞机制理解不足。肺部的癌前病变，如非典型腺瘤样增生（AAH）和原位腺癌（AIS），为临床干预提供了宝贵的“时间窗”。然而，这些病变具有高度的异质性，其演进轨迹可从惰性、甚至消退，到快速恶化为侵袭性癌，这给临床风险分层和治疗决策带来了巨大挑战。

以往的研究多基于组织样本的批量测序，虽然揭示了从正常肺组织到癌前病变乃至LUAD的分子和免疫演变轨迹，但这些改变大多在病变早期即已发生。这些研究方法的局限性在于无法精确解析驱动LUAD发生发展的特定上皮细胞与免疫细胞间的相互作用和通讯网络。此外，由于最早的LUAD前体病变（如AAH）很少被单独手术切除，大多是在肺癌切除标本中偶然发现，因此获取用于深入研究的样本非常困难。

近年来，空间多组学技术，特别是空间转录组学的突破，使我们能够以前所未有的分子精度解析组织的空间结构。然而，一个全面描绘肺脏癌前病变和癌症 across 不同疾病阶段的复杂生态系统的空间图谱仍然缺失。一些关键问题悬而未决：肺脏前体细胞如何进展？它们的生态位和细胞邻域是否与更晚期病变（如微浸润腺癌MIA和LUAD）有所不同？地理异质性（如癌前和癌细胞状态、免疫细胞特性的区域差异）在驱动肿瘤演进中的作用仍不清楚。

为了解决这些知识空白，Peng等人发表在《Cancer Cell》上的研究采用了一种多模态组学策略，构建了高分辨率的空间图谱，旨在更好地理解从正常肺组织到癌前病变，直至LUAD的病理演进连续谱。这项研究不仅深化了我们对肺癌发生机制的基础理解，更重要的是为针对肺癌发展最脆弱阶段的、基于情境（分期特异性）的拦截治疗策略提供了空间路线图。

为了开展这项研究，研究人员整合运用了多种前沿技术。他们首先对来自25例LUAD患者的56个人类组织样本（包括AAH、AIS、MIA、LUAD及正常组织）进行了Visium CytAssist空间转录组学（ST）分析，共分析了486,519个位点。同时，他们对匹配的75个样本（来自23例患者）进行了单核RNA测序（snRNA-seq），并在一部分病例中进行了单细胞分辨率的空间分析（Xenium平台）。此外，他们还利用组织微阵列（TMA）对另一个包含36个病变的独立队列（19例患者，188个组织核心）进行了深度验证。在动物模型方面，研究使用了Gprc5a^-/-小鼠肺癌模型以及Kras^LSL-G12D基因工程小鼠模型，并进行了scRNA-seq、ST、类器官培养、体内抗体阻断治疗（抗IL-1β、抗PD-1）等一系列功能实验和机制探讨。

多模态空间组学揭示区分前体病变和侵袭性LUAD的区域特异性表达模式

研究人员通过ST分析发现，前体病变（AAH和AIS）的位点聚集紧密，而侵袭性LUAD的位点则表现出显著的异质性。与前体病变相比，LUAD相关位点表达了更高的与肺泡II型细胞（AT2）去分化相关的标志物（如KRT8, CEACAM5）和肿瘤标志物（如EGFR, TFF3），提示侵袭性LUAD中可塑性和肺泡去分化增加。通过空间分辨率增强技术iStar，研究证实了差异表达基因（DEGs）与特定组织区域（如正常组织、肿瘤、免疫和基质成分）具有稳健的空间关联。

前体病变和LUAD中的拷贝数改变和克隆结构的空间景观

通过SpatialInferCNV分析上皮位点的拷贝数变异（CNA），研究人员重建了每个患者的克隆结构。他们根据系统发育树和前体与侵袭性病变之间共享的克隆，将病例分为两种主要进化模式。模式1a（n=5）中，在前体病变中检测到的克隆也存在于配对的侵袭性病变中，后者还获得了额外的亚克隆。模式1b（n=13）则同时存在共享克隆和分期特异性克隆。模式2（n=5）中，前体和侵袭性病变之间没有共享克隆。空间定位分析显示，最早的克隆定位于反应性II型肺炎细胞（RPII），这些细胞被认为是KRT8^high肺泡中间细胞（KACs）的组织学对应物，是LUAD的祖细胞。

反应性肺炎细胞是KRT8⁺肺泡细胞，代表LUAD的早期前体

snRNA-seq分析揭示了上皮细胞的不同谱系，包括一个位于AT2和肿瘤细胞之间的KRT8^high肺泡中间细胞（KAC）亚群。KACs处于AT2向AT1分化以及向侵袭性细胞发展的轨迹交叉点，表现出伪时间进展和分化程度降低。非负矩阵分解（NMF）分析确定了9个上皮元程序（MP）。KACs的MP景观与病变相似，肺泡MP2减少而肿瘤相关MP6增加。通过整合snRNA-seq和ST数据，研究发现组织学上的RPII是KACs的原位对应物，它们保留了肺泡特征（MP2），但共表达肿瘤/ KAC MP6和炎症/应激MP7，表明其在从正常肺泡细胞向肿瘤表型偏离的早期作用。克隆分析显示，RPII通常位于与肺前体病变共享克隆的区域，特别是在进化模式1a的病例中。

反应性肺炎细胞存在于富含促炎巨噬细胞的生态位中

通路分析显示，促炎基因集在KACs中最为富集。从ST数据中鉴定出的11个MP与特定细胞谱系和疾病分期相关。值得注意的是，前体MP3与髓系MP5（巨噬细胞）呈显著正相关，提示RPII和肺前体病变在空间上靠近髓系细胞亚群。配体-受体相互作用分析发现，IL1B-IL1R1是前体病变中髓系与上皮细胞之间最富集的相互作用对之一。KACs和前体病变中IL1R1的表达显著高于正常肺泡亚群或LUAD细胞。空间分析显示，IL1R1主要定位於前体病变和侵袭性LUAD与正常实质交界处的边缘区域，而IL1B则富集於病变内部及周边区域，两者重叠区域显示出强烈的IL1B-IL1R1相互作用信号。

上皮-促炎微环境具有分期特异性并在前体病变中富集

单细胞分辨率Xenium分析进一步证实了上述发现。肺泡谱系细胞分析确定了KACs和一个发炎的AT2亚群。KACs表现出最高的KAC评分，而发炎AT2亚群则高表达炎症特征。细胞邻域分析显示，KACs、AAH和发炎AT2细胞的邻域中含有显著更多的IL1B^high巨噬细胞（C15亚群）。RPII和AAH细胞高表达IL1R1，并与IL1B^high巨噬细胞紧密相邻。对TMA的Xenium分析也发现，一个高表达IL1B的巨噬细胞亚群（C4）在AAH、AIS和MIA的邻域中比在LUAD中更为富集。这些结果共同表明，上皮-促炎微环境是LUAD pathogenesis 的一部分，并且具有分期特异性，在早期肺前体病变中普遍存在。

上皮-促炎微环境在Kras突变肺肿瘤发生早期即富集

在烟草致癌物NNK诱导的Gprc5a^-/-小鼠肺癌模型中，scRNA-seq分析显示，与AT1、AT2甚至肿瘤细胞相比，KACs表达最高水平的Il1r1以及NF-κB亚基Rela和Relb。ST分析发现，KAC和促炎症信号在肿瘤区域及其周围巨噬细胞富集的瘤周微环境中共同高表达且共定位。配体-受体相互作用分析识别出从病变周围区域（富含巨噬细胞）向肿瘤核心传导的高度浓缩的Il1b-Il1r1信号。功能上，在肺上皮特异性表达Kras^LSL-G12D的小鼠中敲除Il1r1，可显著减少Kras突变肺肿瘤的发生和正常肺泡区LAMP3⁺/KRT8⁺细胞的丰度。从NNK处理的Gprc5a^-/-; Krt8^CreER; Rosa^tdT/+小鼠分离的AT2细胞来源的KRT8⁺类器官，在与肺巨噬细胞共培养或使用重组IL-1β处理后，其数量和大小均显著增加，表明IL-1β–IL1R1轴在驱动KACs肿瘤发生中的重要作用。

靶向IL-1β治疗可抑制促肿瘤炎症并联合免疫检查点阻断抑制LUAD发展

为了验证拦截IL-1β信号是否能抑制肺泡细胞转化从而阻止LUAD发展，研究人员在NNK暴露的Gprc5a^-/-小鼠中进行了抗体治疗实验。在癌前阶段（预防早期病变发展或拦截早期病变进展）给予抗IL-1β单药、抗PD-1单药或两者联合治疗。结果显示，与抗PD-1单药相比，抗IL-1β在减少肺腺瘤和腺癌体积方面更有效。联合IL-1β和PD-1阻断则能产生显著的协同抗肿瘤效果，尤其在拦截阶段。抗IL-1β治疗显著降低了支气管肺泡灌洗液（BALF）中促肿瘤炎症细胞因子（如CCL3, IL33, IL17A）的水平。scRNA-seq分析显示，联合治疗能最有效地减少上皮细胞中KACs和肿瘤细胞的比例，并增加细胞毒性CD8⁺ T细胞浸润。免疫荧光分析进一步证实，联合治疗不仅能抵消PD-1单药引起的巨噬细胞增多，还能带来最高水平的细胞毒性CD8⁺ T细胞浸润。这些结果表明，在癌前阶段靶向IL-1β信号可破坏肺泡祖细胞向肿瘤前体细胞的转化，有效抑制LUAD的发生发展。

本研究通过多模态单细胞和空间组学分析，结合功能验证，揭示了上皮-促炎微环境在驱动LUAD发生中的核心作用，并强调了其在癌前阶段的特异性。研究发现，肺泡祖细胞（KACs/RPII）在分子和克隆水平上比可识别的肺前体病变更为“祖先”，它们所处的促炎微环境，特别是IL-1β–IL1R1信号轴，在肺癌启动中扮演了关键角色。更重要的是，这种促炎微环境在癌前病变阶段更为活跃和普遍，而在侵袭性癌中相对减弱，这为理解为何针对晚期癌症的抗炎治疗（如canakinumab联合化疗/免疫治疗）疗效有限，而其在癌前干预（如CANTOS试验）中显示出潜力提供了可能的解释。该研究不仅为LUAD的早期发生机制提供了深刻见解，更重要的是，提出了针对癌前特定微环境进行早期拦截的创新性治疗策略，具有重要的临床转化意义。研究的局限性包括基于ST的CNA推断可能受spot内细胞异质性影响，以及手术样本存在的潜在采样偏差。未来研究结合空间DNA测序和体内谱系追踪与扰动将有助于更精确地解析LUAD的克隆进化并验证上皮-促炎微环境的因果作用。