综述：解析Oct4增强子在多能干细胞和小鼠胚胎发生中的功能

《Stem Cell Reports》：Dissecting Oct4 enhancer function in pluripotent stem cells and mouse embryogenesis

本刊特邀评论文章深入剖析了Oct4基因增强子的核心功能。作者通过对比内源性Oct4基因座操作与传统报告基因系统的差异，揭示了APE（近端增强子）和DE（远端增强子）在胚胎发育不同阶段（从囊胚到原肠胚）调控Oct4表达的精确机制，强调了在天然基因组背景下研究调控元件的必要性，为研究发育相关基因及增强子疾病提供了新范式。

　　

Dissecting Oct4 enhancer function in pluripotent stem cells and mouse embryogenesis

Oct4：多能性的关键调控因子

Oct4（又称Oct-3/4）是脊椎动物发育过程中一个至关重要的转录因子。它最初被鉴定为在小鼠植入前、植入后早期胚胎以及原始生殖细胞的多能性细胞群体中表达的因子（Scholer et al., 1990）。鉴于生殖细胞在体外可被转化为多能性胚胎生殖细胞（Resnick et al., 1992）并能在体内产生畸胎瘤，科学家推测Oct4可能是多谱系分化潜能的“主调控因子”。随后的研究证实，Oct4对于小鼠中幼稚多能性（类似于植入前状态）的建立和维持既是必需的，也是不可替代的（Niwa et al., 2000; Radzisheuskaya et al., 2013; Karwacki-Neisius et al., 2013）。在小鼠植入后外胚层中条件性敲除Oct4会导致组织结构紊乱、体轴破坏、发育停滞在原肠胚形成起始阶段，并在胚胎第8.5天（E8.5）完全无法形成解剖结构（Mulas et al., 2018）。

早期研究：报告基因系统的探索与局限

为了研究Oct4的调控机制，研究人员利用Oct4转录起始位点上游区域构建了转基因报告系统，用以驱动LacZ或GFP的表达，并辅以一系列内部缺失实验（Yeom et al., 1996; Yoshimizu et al., 1999）。一个18 kb的片段（GOF-18）似乎能够重现Oct4在多能状态和生殖细胞发育过程中的表达模式。删除一个小的间隔区会导致报告基因表达完全丧失，而删除邻近的近端增强子（APE）元件对胚胎干细胞（ESCs）、植入前胚胎或原始生殖细胞中的报告基因活性影响甚微（Yoshimizu et al., 1999; Yeom et al., 1996）。然而，在植入后外胚层、植入后样的人ESCs以及小鼠上胚层干细胞（EpiSCs）中，报告基因活性会下调并过早消失（Yoshimizu et al., 1999; Theunissen et al., 2014; Tesar et al., 2007）。另一方面，删除更远端的增强子（DE）元件对植入后外胚层或EpiSCs中的报告基因表达影响最小，但会阻止其在植入前胚胎和小鼠ESCs中的表达（Tesar et al., 2007; Yoshimizu et al., 1999）。

然而，这种早期的报告基因方法存在缺陷。报告基因在基因组中的整合位置可能影响其表达和调控。更遥远的调控元件可能未被包含在这些报告基因构建体中。此外，这些报告基因必须从头建立其表观遗传状态，因此可能形成与内源性基因座不同的表观遗传谱。

内源性基因操作的新见解：APE和DE的功能

近期研究通过直接操作内源性Oct4基因座的增强子元件，揭示了与报告基因研究不一致但更为精确的结果。

近端增强子（APE）在退出多能性过程中的作用

对内源性APE元件的破坏研究发现，其对小鼠囊胚的影响微乎其微。携带这种内源性APE修饰的小鼠ESCs能够进行多谱系分化，但在退出多能性过程中经历高比率的细胞凋亡，这表明Oct4在细胞退出多能性后的存活中起着关键作用。相应地，作者发现将APE ESCs注射到野生型囊胚后，这些细胞在原肠胚形成后期仅能极少量地贡献到嵌合体中，对活产幼鼠的贡献也非常有限。有趣的是，作者发现APE细胞在体外分化的最初几天仍能持续表达Oct4，这一时期细胞正经历短暂的 formative 状态转变，之后Oct4表达丢失，细胞在向定型分化状态推进时无法维持多能性。

远端增强子（DE）在植入前表达中的复杂调控

研究团队通过杂交杂合子小鼠产生了ΔDE胚胎，以研究DE（已知对Oct4植入前表达至关重要）的体内需求。尽管删除了该增强子，他们在E3.5的囊胚中仍观察到了Oct4的表达，这与之前使用ΔDE报告基因构建体的研究结果相反（后者中报告基因活性直到植入后才被观察到）（Yoshimizu et al., 1999）。这一发现表明，更遥远的调控区域，或者内源性Oct4基因座复杂的表观遗传调控（这些是外源性报告基因分析所无法完全模拟的），可能在内细胞团分化为上胚层和胚外内胚层以及建立幼稚多能性区域之前，对Oct4的调控至关重要。

展望未来：技术与应用的延伸

这些发现凸显了在天然背景下操作内源性基因组元件以全面理解其功能的重要性。本研究团队所采用的方法无疑将在未来扩展到条件性基因敲除的实施，以研究不同增强子元件在更晚发育阶段的功能，例如内源性Oct4远端增强子在原始生殖细胞发育中的作用。这些进展也将有助于在人类幼稚多能性干细胞以及人类发育模型（如类原肠胚）中研究Oct4增强子元件。此外，这些相同的技术将直接适用于研究其他基因的调控，包括其他发育相关因子以及与增强子病相关的基因，后者在疾病中的作用正日益受到重视。