靶向补体C3的纳米抗体基因疗法：湿性年龄相关性黄斑变性的治疗新策略

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Nanobody-based gene therapy targeting complement component C3 reduces choroidal neovascularization in mice

本研究针对湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)现有抗VEGF疗法需多次注射、长期疗效有限的临床困境，开发了基于纳米抗体的基因治疗新策略。研究人员通过构建表达hC3Nb1纳米抗体的慢病毒载体，证实其可在视网膜色素上皮细胞中稳定表达并有效抑制补体替代通路，显著降低激光诱导的小鼠脉络膜新生血管(CNV)面积。该研究首次实现了眼部纳米抗体基因治疗的疗效验证，为wAMD及其他补体异常激活性眼病提供了潜在的长效治疗方案。

　　

随着全球人口老龄化加剧，年龄相关性黄斑变性(AMD)已成为老年人不可逆视力丧失的主要原因。其中，湿性AMD(wAMD)以脉络膜新生血管(CNV)为特征，异常血管破裂导致出血和渗出，严重威胁中心视力。目前临床主要采用抗血管内皮生长因子(VEGF)药物进行玻璃体内注射，虽能暂时缓解症状，但患者需频繁接受治疗（每月或每两月一次），长期随访显示视力改善难以维持，且约10%-35%患者会出现耐药现象。这种高频率的治疗方案不仅给患者带来沉重负担，也增加了眼内感染等并发症风险。

更为棘手的是，研究表明wAMD的发病机制与补体系统过度激活密切相关。补体系统作为先天免疫的重要组成部分，其替代通路的异常放大可引发炎症反应、招募VEGF分泌型巨噬细胞、形成膜攻击复合物(MAC)，最终导致视网膜损伤。然而，传统补体抑制剂分子量较大(40-200 kDa)，难以穿透视网膜色素上皮(RPE)-Bruch膜复合体到达靶组织。面对这一挑战，研究人员将目光投向了纳米抗体——这种源自骆驼科动物单域抗体的微小分子(约15 kDa)，具有组织穿透性强、稳定性高、免疫原性低等独特优势。

在这项发表于《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》的研究中，研究团队开创性地将靶向补体C3的纳米抗体hC3Nb1与基因治疗技术相结合，旨在开发一种长效、安全的wAMD治疗新策略。他们通过双启动子慢病毒载体系统，实现了hC3Nb1与报告基因eGFP在视网膜细胞中的协同表达，并系统评估了该疗法在体外和动物模型中的治疗效果与安全性。

研究团队主要采用了四种关键技术方法：通过分子克隆构建纳米抗体表达载体；利用蛋白质印迹和免疫荧光技术检测纳米抗体的表达与分泌；采用补体片段沉积实验评估通路抑制效果；建立激光诱导的小鼠CNV模型进行体内疗效验证。实验选用8-9周龄C57BL/6J雄性小鼠，通过视网膜下注射方式递送治疗载体。

功能性补体抑制纳米抗体在哺乳动物细胞中的高效表达与分泌

研究人员首先构建了四种纳米抗体表达载体，包括靶向替代通路的hC3Nb1、其失活突变体hC3Nb1-W102A、广谱抑制剂hC3Nb2以及经典/凝集素通路抑制剂C4Nb。实验显示，转染HEK293细胞后，所有纳米抗体均能在细胞质内呈现颗粒状分布模式，并有效分泌至培养基中。功能实验证实，hC3Nb1不仅能完全抑制替代通路，还意外地部分抑制了经典通路，这可能与其阻断C3转化酶对C3的切割作用有关。

双启动子慢病毒载体实现纳米抗体与eGFP的最佳共表达

为获得稳定的体内表达，研究团队比较了内部核糖体进入位点(IRES)系统和背对背双启动子系统（VMD2-eGFP+PGK-hC3Nb1）的表达效率。结果表明，双启动子系统不仅能介导更高水平的hC3Nb1分泌，还实现了更强的eGFP表达，因此被选为后续实验的载体平台。

hC3Nb1保护ARPE-19细胞免受补体介导的单层破坏

在体外功能验证中，研究人员将表达hC3Nb1的慢病毒载体转导至ARPE-19细胞，建立稳定细胞系。通过跨上皮电阻(TEER)检测发现，在过氧化氢(H₂O₂)和正常人血清(NHS)诱导的应激条件下，未转导细胞单层完整性在24小时内下降30.5%，而hC3Nb1表达细胞仅出现短暂电阻下降，24小时后完全恢复，证明纳米抗体能有效抵抗补体介导的细胞应激损伤。

小鼠视网膜下递送后实现高效长期纳米抗体表达

体内实验显示，视网膜下注射慢病毒载体后3周和8周，均能在RPE层检测到hC3Nb1和eGFP的稳定表达。免疫荧光显示纳米抗体在RPE细胞分泌系统中呈颗粒状分布，蛋白质印迹进一步证实其在神经视网膜/RPE/脉络膜组织中的长期存在。值得注意的是，纳米抗体还能从RPE细胞顶膜和基底膜双向分泌，提示其可能扩散至邻近组织发挥广泛抑制作用。

hC3Nb1通过补体抑制安全减小激光诱导的CNV病灶面积

在激光诱导的CNV模型中，hC3Nb1治疗组较失活纳米抗体对照组显著减少CNV面积达49%。补体激活标志物C3d染色显示，hC3Nb1表达视网膜中C3d阳性面积和强度均显著降低，表明疗效与补体抑制直接相关。安全性评估显示，治疗组视网膜电图(ERG)的a波、b波和c波振幅与对照组无显著差异，血清中未检测到抗纳米抗体抗体，证明长期视网膜表达具有良好的安全性。

研究结论与讨论部分强调，这是首次证实载体递送的纳米抗体在眼部疾病治疗中的可行性。该疗法通过持续局部生产hC3Nb1，克服了传统补体抑制剂半衰期短、组织穿透性差的局限。尤其值得注意的是，纳米抗体的小分子特性使其易于穿透Bruch膜，靶向位于脉络膜毛细血管的补体激活中心。与目前处于临床阶段的sCD59基因疗法（仅抑制MAC形成）相比，hC3Nb1能更上游地阻断补体级联反应，抑制替代通路放大、炎症细胞招募等多重病理过程。

尽管该研究存在未检测CNV后视网膜功能变化、缺乏分子标志物动态监测等局限，但无疑为wAMD治疗开辟了新方向。未来可进一步探索hC3Nb1与其他抗血管生成药物的联合疗法，或开发靶向多重病理环节的纳米抗体组合策略。这种基于纳米抗体的基因治疗平台不仅适用于AMD，也有望应用于其他补体异常激活相关的视网膜疾病，展现出广阔的临床转化前景。