使用聚乙烯亚胺改性海绵状整体柱对RNA-脂质纳米颗粒进行离子排斥色谱分离

《Analytica Chimica Acta》：Ion Exclusion Chromatography of RNA–Lipid Nanoparticles using Polyethyleneimine-Modified Spongy Monoliths

针对RNA脂质纳米颗粒（LNPs）在尺寸排阻色谱（SEC）中过度吸附的问题，本研究开发了一种聚乙烯亚胺（PEI）修饰的泡沫多孔材料（SPM）柱，通过离子排斥色谱（IEC）实现LNPs快速分离，并整合至二维液相色谱-质谱（2D-LC/MS）联用技术，揭示不同亚群LNPs的配体比例差异，应用于反复冻融循环的稳定性测试。

　　近年来，随着基因治疗和疫苗技术的迅速发展，脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）作为核酸传递载体的重要性日益凸显。LNPs不仅能够保护易降解的核酸物质免受细胞内外核酸酶的破坏，还能够促进内吞作用，从而提高治疗效果。然而，LNPs的复杂性和异质性给其分析带来了巨大挑战。传统的分析方法通常基于批次处理，难以有效区分LNPs中的不同亚群，这在评估其稳定性、纯度和组成时尤为关键。此外，LNPs在常规分离介质上的强吸附特性，使得在进行分离前需要进行样品预饱和处理，这不仅增加了实验的复杂性，还可能引入样品残留，影响分析结果的准确性。

针对上述问题，研究人员开发了一种基于离子排斥色谱（Ion Exclusion Chromatography, IEC）的新型分离方法，以实现对LNPs的快速、高效分析。该方法利用了聚乙烯醇（PEG）修饰的多孔性单体柱（Spongy Monolith, SPM），通过化学修饰提高了柱子的渗透性和电荷排斥能力。这种方法在不牺牲样品的情况下，能够有效减少LNPs在分离介质上的吸附，从而提高分离效率和准确性。通过将IEC与二维液相色谱-质谱（2D-LC/MS）相结合，研究人员能够更全面地分析LNPs的组成差异，特别是在不同冻融循环条件下对表面电荷和组成异质性的评估。

LNPs通常由四种主要脂质成分构成：阳离子-可离子化脂质、磷脂、胆固醇和PEG修饰的脂质。其中，可离子化脂质在高效核酸封装和促进内吞作用中起着关键作用。这些脂质在生理pH条件下保持中性，但在酸性环境中或在RNA负载的自组装过程中会带上正电荷。因此，可离子化脂质的设计和优化对于提高LNPs的性能至关重要。磷脂和胆固醇则在维持LNPs结构稳定性和生物分布方面发挥重要作用。PEG修饰的脂质则有助于防止颗粒聚集，延长其在体内的循环时间。

尽管LNPs在传统分离技术中的应用存在诸多挑战，但近年来，多孔性单体柱的出现为解决这些问题提供了新的思路。多孔性单体柱以其较大的孔径和较低的系统背压，能够容纳更大尺寸的纳米颗粒，并且在高通量分析中表现出色。此外，这些柱子的结构设计减少了表面吸附的可能性，从而提高了分离的准确性和重现性。通过化学修饰，多孔性单体柱可以进一步适应不同的分离需求，例如用于离子交换的二乙胺（DEA）修饰或用于亲和分离的环氧基修饰的聚（乙烯-共-丙烯酸酯）（PEGM）。

在本研究中，研究人员评估了LNPs在大小排除色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC）介质上的吸附特性，并利用质谱技术对未标记和稳定同位素标记的脂质成分进行了分析。结果显示，未标记LNPs在进行预饱和处理后，能够与注入的标记LNPs发生交换，从而揭示了吸附机制。随后，研究人员开发并表征了PEG修饰的多孔性单体柱，发现其物理性质与未修饰柱子相似，但能够显著减少LNPs的吸附。通过将IEC与二维液相色谱-质谱结合，研究人员能够更全面地分析LNPs的组成差异，并在冻融循环条件下评估其稳定性。

本研究的结果表明，使用PEG修饰的多孔性单体柱能够有效解决LNPs在传统分离介质上的吸附问题，从而提高分析的准确性和效率。这种新型分离方法不仅适用于不同类型的LNPs，还能够满足高通量分析的需求。通过结合IEC和二维液相色谱-质谱，研究人员能够更深入地了解LNPs的组成和行为，为未来LNPs的设计和优化提供了重要的参考。此外，这种方法的开发也为基因治疗和疫苗研究中的稳定性评估提供了新的工具，有助于提高治疗的安全性和有效性。