褪黑激素受体在四眼睡鼠（Bostrychus sinensis）精子发生过程中的不同作用（体外研究）

《Aquaculture Reports》：Distinct roles of melatonin receptors in spermatogenesis in vitro in four-eyed sleeper ( Bostrychus sinensis)

褪黑素通过膜受体调控四眼睡莲鱼体外精子发生，利用spheroid微盘改进3D培养体系显著提升haploid精子产量，并揭示Mtnr1、Mtnr2和Mtnr3对ERK1/2、CAMK2和CREB信号通路的差异化调控作用。

　　这项研究围绕一种重要的神经内分泌激素——褪黑素，探讨了其在鱼类精子生成中的作用机制，特别是通过一种改进的三维（3D）培养系统。褪黑素在动物界中主要负责调控昼夜节律和季节性繁殖行为，近年来的研究表明，它在不同物种的生殖生理过程中发挥着关键作用。研究人员通过使用一种无支架的3D材料——球形微孔板，显著提高了精子生成效率，并进一步揭示了褪黑素受体（Mtnr1、Mtnr2和Mtnr3）在这一过程中的具体功能。

### 褪黑素的生物学功能与作用机制

褪黑素是一种由松果体分泌的激素，其作用不仅限于调节昼夜节律，还涉及免疫、代谢、神经功能和生殖等多个方面。在哺乳动物中，褪黑素通过与细胞膜上的受体（Mtnrs）相互作用，激活多种信号通路，包括cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化、钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（CAMK2）的激活以及ERK1/2信号通路的调节。这些信号通路在细胞增殖、分化和功能维持中发挥重要作用。此外，褪黑素还能通过非受体依赖机制，如直接穿过细胞膜并清除活性氧（ROS）和过氧化物，或者进入细胞核与视黄酸受体相关孤儿受体α（Rorα）结合，调控基因转录。

在鱼类中，褪黑素的作用也受到广泛关注。例如，在某些鱼类中，褪黑素能够促进卵泡成熟，这与促性腺激素释放激素（GnRH）和Kisspeptin的分泌有关。同时，褪黑素还能直接调控生殖细胞的发育，例如在 Suffolk 羊中促进精原干细胞（SSCs）分化为单倍体精子，而在四眼鱼（Bostrychus sinensis）中，褪黑素能够促进精原细胞的增殖和分化，从而生成功能性精子。然而，褪黑素如何具体调控精子生成的机制仍不完全清楚，尤其是在体外培养系统中的作用。

### 四眼鱼精子生成的体外研究

为了更深入地研究褪黑素在四眼鱼精子生成中的作用，研究人员改进了传统的3D培养方法，采用无支架的球形微孔板，以提高单倍体细胞的生成效率和功能性精子的产量。与传统的转膜培养相比，球形微孔板能够更有效地促进细胞聚集，形成类似于睾丸的球状结构，并且显著缩短了生成单倍体细胞所需的时间。实验结果显示，在球形微孔板中，单倍体细胞的比例达到了19.37%，远高于转膜培养中的2.23%。这表明，球形微孔板是一种更高效的3D培养系统，有助于研究精子生成的分子机制。

此外，研究人员发现，褪黑素在球形微孔板培养中显著提高了其膜受体（Mtnr1、Mtnr2和Mtnr3）的表达水平，而非核受体Rorα的表达未见明显变化。这一发现提示，褪黑素可能主要通过膜受体调控精子生成。为了进一步验证这一假设，研究人员克隆并表征了四眼鱼的Mtnr同源基因，并发现它们在不同组织中具有不同的表达模式。例如，Mtnr1在脑和睾丸中高度表达，而Mtnr2和Mtnr3则主要在肝脏和脾脏中表达。这些受体在睾丸发育的不同阶段均表达，特别是在6个月后出生的睾丸中达到高峰，表明它们在睾丸成熟过程中可能具有重要的调控作用。

### 褪黑素受体在精子生成中的不同功能

通过敲低实验，研究人员发现Mtnr1、Mtnr2和Mtnr3在调控精子生成中的作用存在显著差异。首先，Mtnr1的抑制导致单倍体精子的显著减少，同时也影响了细胞增殖相关基因（如CyclinA、Cdk1和Cdk2）的表达。此外，Mtnr1还调控了CREB和CAMK2的磷酸化，这可能与其在精子生成中的关键作用有关。相比之下，Mtnr2和Mtnr3的抑制对细胞增殖相关基因的影响较为复杂：Mtnr2的抑制显著增加了这些基因的表达，而Mtnr3的抑制则降低了它们的表达。此外，Mtnr2和Mtnr3的抑制均显著降低了减数分裂相关基因（如Sycp3和Dmc1）的表达，而Mtnr1的抑制对这些基因的影响更为显著。

在信号通路方面，研究人员发现Mtnr1主要调控ERK1/2、CREB和CAMK2的磷酸化，而Mtnr2仅影响CREB的活性，Mtnr3则主要调控ERK1/2和CAMK2的激活。这些差异提示，不同的褪黑素受体可能通过不同的信号通路发挥不同的生理功能。例如，Mtnr1可能在调控细胞增殖和分化方面起着主导作用，而Mtnr3可能在减数分裂过程中具有更重要的影响。

### 褪黑素在生殖调控中的潜在作用

褪黑素不仅在哺乳动物中调控生殖过程，也在鱼类中发挥重要作用。在四眼鱼中，褪黑素能够通过促进精原细胞的增殖和分化，提高功能性精子的产量。然而，褪黑素的具体作用机制仍需进一步研究。例如，褪黑素是否通过激活某些特定的信号通路，或者是否与其他激素（如促性腺激素）协同作用，共同调控精子生成。此外，褪黑素是否能够通过调控Sertoli细胞和Leydig细胞的功能，间接影响精子生成，也是一个值得探讨的问题。

值得注意的是，褪黑素在不同组织中的作用可能存在差异。例如，在肝脏中，褪黑素可能通过Mtnr1调控PKA信号通路，从而减轻肝纤维化。而在睾丸中，褪黑素可能通过不同的受体和信号通路，调控精子的生成和成熟。这种组织特异性的作用可能与褪黑素受体的分布和功能有关，也可能是不同物种适应环境的体现。

### 研究的意义与应用前景

这项研究不仅揭示了褪黑素受体在四眼鱼精子生成中的具体作用，还为体外精子生成技术的优化提供了新的思路。通过改进3D培养系统，研究人员能够更高效地生成单倍体精子，这对于研究精子生成的分子机制具有重要意义。此外，褪黑素受体的多样性及其在不同组织中的表达模式，也提示其在多种生理过程中的潜在作用，如免疫调节、神经发育和细胞增殖等。

从应用角度来看，这项研究为水产养殖领域提供了新的技术手段。四眼鱼因其肉质鲜美、营养丰富和生长迅速，已成为东南亚地区重要的养殖对象。然而，约15%的雄性个体存在不育问题，这可能导致种质资源的严重损失。通过体外培养技术，研究人员可以更有效地生成功能性精子，为四眼鱼的繁殖和种质保存提供技术支持。此外，该技术还可以用于其他鱼类的精子生成研究，为鱼类生殖调控提供更广泛的理论基础和实践应用。

### 实验方法与技术细节

为了实现上述研究目标，研究人员采用了多种实验方法，包括组织分离、细胞培养、基因表达分析、蛋白质磷酸化检测以及荧光原位杂交（FISH）等。首先，他们从四眼鱼的睾丸中分离出精原细胞，并将其培养在球形微孔板和转膜中。结果显示，球形微孔板能够更有效地促进细胞聚集和精子生成，表明其在3D培养中的优越性。

在基因表达分析方面，研究人员使用qPCR技术检测了Mtnr同源基因的表达水平，并发现这些基因在不同组织中具有不同的表达模式。此外，他们还通过荧光原位杂交技术，观察了Mtnr同源基因在睾丸不同细胞类型中的分布情况，发现它们在支持细胞、精原细胞和精母细胞中均有表达，提示其可能通过细胞间通信调控精子生成。

在蛋白质磷酸化检测方面，研究人员使用Western blot技术分析了不同褪黑素受体对下游信号通路的影响。结果显示，Mtnr1、Mtnr2和Mtnr3对ERK1/2、CREB和CAMK2的磷酸化具有不同的调控作用，这为理解褪黑素受体的功能提供了重要的实验依据。

### 未来研究方向

尽管这项研究取得了重要进展，但仍有一些问题需要进一步探索。例如，褪黑素是否通过其他信号通路调控精子生成？不同褪黑素受体之间的相互作用是否会影响其功能？此外，褪黑素受体的表达是否受到环境因素的影响，如光照、温度和营养条件？这些问题的答案将有助于更全面地理解褪黑素在鱼类生殖中的作用机制。

从技术角度来看，球形微孔板作为一种新型的3D培养材料，具有广阔的应用前景。未来的研究可以进一步优化该培养系统，提高精子生成的效率和质量。此外，还可以探索该技术在其他鱼类中的适用性，为水产养殖和生物技术的发展提供新的工具和方法。

总之，这项研究不仅揭示了褪黑素受体在四眼鱼精子生成中的具体作用，还为体外精子生成技术的优化提供了新的思路。褪黑素作为一种重要的神经内分泌激素，其在生殖调控中的作用可能远不止于此，未来的研究将进一步探索其在其他生理过程中的潜在功能。