一种通过光活化交联制备的聚合物三酶纳米颗粒，用于骨肉瘤的级联催化治疗

《Bioactive Materials》：A polymeric triple-enzyme nanoparticle by light activatable crosslinking for cascade catalytic therapy of osteosarcoma

多酶纳米粒子NBGLC通过光激活交联负载葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶和氯过氧化物酶，协同催化产生单线态氧和次氯酸，诱导肿瘤细胞凋亡和铁死亡，有效抑制骨肉瘤生长且无显著毒性。

　　本研究聚焦于一种新型的纳米颗粒药物递送系统，旨在通过多酶级联反应实现对骨肉瘤的协同治疗。这种策略的核心在于利用生物催化反应增强肿瘤细胞内的活性氧（ROS）水平，从而破坏癌细胞的生存环境并诱导其死亡。研究人员选择了一种可生物降解的聚合物——ε-聚赖氨酸（ε-PLL）作为载体，通过特定的化学修饰和光激活交联技术，成功将葡萄糖氧化酶（GOx）、乳酸氧化酶（LOx）和氯过氧化物酶（CPO）封装在纳米颗粒中，形成一种名为NBGLC的多酶复合物。这种纳米颗粒不仅能够在体外高效地促进ROS的生成，还在体内展现出良好的抗肿瘤效果，同时对正常组织的损伤较小，显示出较高的生物安全性。

### 多酶级联反应在癌症治疗中的潜力

癌症细胞在生长和增殖过程中，依赖于复杂的代谢和信号传导机制。其中，ROS在肿瘤生物学中扮演着双重角色：在生理浓度下，它们作为信号分子参与细胞功能调控；当其浓度超过细胞抗氧化能力时，则会引发氧化应激，导致DNA损伤、蛋白质变性以及细胞器功能障碍。因此，通过调控ROS水平来干预肿瘤细胞的生存状态，成为癌症治疗的一个重要方向。然而，传统的ROS生成方法存在诸多限制，如外部刺激难以穿透组织、纳米酶在肿瘤微环境中的催化效率和稳定性不足等。

在此背景下，多酶级联反应成为一种极具潜力的解决方案。这种策略通过将多种酶整合在一个系统中，使它们在特定条件下依次发挥作用，从而放大ROS的生成和毒性效应。例如，GOx能够分解肿瘤细胞中的葡萄糖，生成氢过氧化物（H?O?）；LOx则可以分解乳酸，同样产生H?O?；而CPO在H?O?和氯离子（Cl?）存在的情况下，进一步催化生成具有强氧化能力的单线态氧（1O?）。这种多步催化过程不仅提高了ROS的浓度，还增强了其对癌细胞的杀伤力。

然而，自然酶在体内面临蛋白降解和失活的问题，限制了其在肿瘤治疗中的应用。因此，研究人员开发了一种聚合物纳米颗粒，利用光激活交联技术将这些酶稳定地封装在其中，使其在体液中保持活性并靶向释放到肿瘤组织内。这一策略有效克服了传统酶疗法的局限性，为癌症治疗提供了新的思路。

### 聚合物纳米颗粒的制备与特性

本研究中使用的聚合物是通过将O-硝基苯基修饰的ε-PLL（简称为NB）与GOx、LOx和CPO结合形成的。NB-NHS（一种含N-羟基琥珀酰亚胺基团的修饰剂）与ε-PLL在甲醇溶液中反应，生成具有光响应特性的NB聚合物。通过紫外光照射，NB中的硝基苯基基团可以与酶中的赖氨酸残基形成席夫碱键，从而将酶包裹在纳米颗粒内部。这种光激活交联过程不仅提高了纳米颗粒的稳定性，还使其能够在体内保持活性，直到到达目标肿瘤细胞。

通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）对NBGLC纳米颗粒进行了表征。结果表明，经过光激活交联后，纳米颗粒的尺寸显著减小，且具有正电荷特性，这有助于其在体内的靶向性和细胞摄取能力。此外，通过SDS-PAGE和荧光光谱分析，研究人员验证了三种酶的封装效率，分别达到了58.1%、71.1%和70.7%。这些数据表明，NBGLC纳米颗粒能够有效地将多种酶递送至靶点，并保持其生物活性。

### 多酶纳米颗粒的生物活性与机制

在体外实验中，研究人员评估了NBGLC纳米颗粒对骨肉瘤细胞143B的影响。结果显示，单个酶纳米颗粒（如NBG或NBL）虽然能够生成一定量的ROS，但对细胞存活率的影响有限。相比之下，NBGLC纳米颗粒通过多酶级联反应显著提升了ROS的生成量，并诱导了细胞凋亡和铁死亡（ferroptosis）。铁死亡是一种由氧化应激引发的程序性细胞死亡方式，其特征包括脂质过氧化和抗氧化防御系统的失效。研究发现，NBGLC纳米颗粒能够显著降低GPX4（一种重要的抗氧化酶）的表达水平，同时增加MDA（丙二醛，一种脂质过氧化产物）的积累，表明其在诱导铁死亡方面具有显著效果。

此外，研究人员还通过荧光探针检测了细胞内pH值的变化。结果表明，NBGLC纳米颗粒能够显著降低细胞内的pH值，这可能与HClO（次氯酸）的生成有关。HClO不仅具有强氧化性，还能进一步影响细胞膜的完整性，从而促进细胞死亡。这一过程与细胞凋亡的标志物（如CRT和HMGB1的释放）密切相关，说明NBGLC纳米颗粒不仅诱导了细胞凋亡，还触发了免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD），这可能对增强抗肿瘤免疫反应具有重要意义。

### 体内治疗效果与安全性评估

在体内实验中，研究人员使用了携带143B细胞的Balb/c小鼠模型，评估NBGLC纳米颗粒的治疗效果。结果表明，NBGLC能够显著抑制肿瘤生长，且在治疗过程中并未导致小鼠体重明显下降，说明其对正常组织的毒性较低。此外，通过血液检测和肝功能分析，研究人员发现NBGLC对白细胞、红细胞、血红蛋白等血液成分的影响较小，进一步证明了其良好的生物安全性。

通过H&E染色、TUNEL染色和Ki67免疫组化分析，研究人员观察到了NBGLC治疗后肿瘤组织的显著变化。H&E染色显示，NBGLC处理组的肿瘤细胞出现严重的细胞破裂、细胞核消失等现象；TUNEL染色则证实了肿瘤细胞的高凋亡率；Ki67的表达水平下降，表明肿瘤细胞增殖受到抑制。这些结果共同表明，NBGLC纳米颗粒能够有效诱导肿瘤细胞死亡，同时对正常组织的损伤较小。

### 多酶递送系统的优化与前景

尽管NBGLC纳米颗粒在体外和体内实验中均表现出良好的抗肿瘤效果，但其在实际应用中仍需进一步优化。例如，如何提高纳米颗粒在体内的靶向性、如何增强其在肿瘤微环境中的稳定性、以及如何减少对正常细胞的潜在毒性，都是未来研究需要关注的方向。此外，多酶级联反应的效率和持续性也是影响治疗效果的关键因素。

本研究提出的NBGLC纳米颗粒，不仅为癌症治疗提供了一种新的思路，也为其他疾病的治疗带来了启示。通过合理设计多酶递送系统，可以实现对复杂生物反应的精准调控，从而提高治疗的靶向性和效率。未来，研究人员可以进一步探索这种策略在不同癌症类型中的应用，以及如何结合其他治疗手段（如免疫治疗或光动力治疗）以实现更全面的抗肿瘤效果。

总之，多酶级联反应作为一种新兴的生物催化策略，具有广阔的应用前景。NBGLC纳米颗粒的成功开发，不仅展示了其在骨肉瘤治疗中的潜力，也为其他癌症及慢性疾病的治疗提供了新的工具。通过不断优化纳米颗粒的结构和功能，有望在未来实现更高效、更安全的多酶递送系统，为精准医疗和个性化治疗提供支持。