循环中的miRNA与AFP结合使用，可提高对HBV相关肝细胞癌的诊断准确性

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Circulating miRNAs combined with AFP improve diagnostic accuracy for HBV-associated hepatocellular carcinoma

本研究评估了血清miR-21-5p、miR-34a-5p和miR-30d-3p单独及联合AFP对 Vietnamese HBV相关HCC的诊断价值，发现三者的协同作用显著提升AUC（0.92-0.97），为早期筛查提供了新工具。

　　肝细胞癌（HCC）是全球最常见的原发性肝癌类型，占所有肝癌病例的约80%。它也是癌症相关死亡的第三大原因，五年的生存率仅为18%。随着肝癌死亡率的上升，预计到2030年，肝癌每年将导致超过一百万人死亡，凸显了其对全球健康的重大影响。肝癌的高死亡率主要归因于晚期诊断，这限制了治疗选择。鉴于肝癌的侵袭性和不良预后，早期检测对于改善生存率至关重要。

目前用于肝癌诊断的方法包括血清甲胎蛋白（AFP）检测和影像学方法，如腹部超声（US）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）。尽管这些方法被广泛使用，但每种方法都有其显著的局限性。AFP缺乏足够的敏感性和特异性，因为升高的水平也可能出现在慢性肝病如肝炎和肝硬化中。超声虽然非侵入性和成本效益高，但高度依赖操作者，导致准确性存在较大差异。CT提供了详细的影像信息，但涉及电离辐射，而MRI虽然更精确，但成本高且在低资源环境中往往难以获得。肝活检仍是诊断的黄金标准，但它是侵入性的，存在出血等风险，且可能因取样误差而漏诊小肿瘤。

近年来，微小RNA（miRNA）作为肝癌诊断、预后和治疗监测的生物标志物展现出巨大潜力。这些小的、非编码的RNA通过后转录调控基因表达，并在多种癌症中频繁失调，包括肝癌。在循环系统中，如miR-21-5p、miR-34a-5p和miR-30d-3p等miRNA因其在血清中的稳定性及其反映肿瘤特异性分子变化的能力而显示出特别的潜力。miR-21-5p是肝癌中最常被研究的癌基因之一，通过抑制肿瘤抑制基因如PTEN和调节EGFR活性，促进肿瘤发生，从而激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路，支持细胞增殖、存活和转移。相反，miR-34a-5p作为一种肿瘤抑制因子，通常在肝癌中下调。它直接由p53调控，并抑制关键的致癌靶点，包括c-Met、Bcl-2、Cyclin D1和SIRT1，从而破坏PI3K/AKT和RAS/MAPK通路，限制肿瘤生长和侵袭。同样，miR-30d-3p作为miR-30家族成员，通过靶向PI3K/AKT通路的成分和调节通过SIRT1/FOXO3a/PUMA轴的凋亡，以及抑制USP22，最终促进细胞死亡并抑制肿瘤进展。

越南面临着肝癌的重大负担，年龄调整的发病率超过每10万人20例。肝癌高发病率的主要驱动因素是慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染的普遍流行，这是肝癌发展的已知风险因素。尽管miRNA作为肝癌的生物标志物已引起关注，但其在越南人群中的诊断价值仍处于探索阶段。鉴于更有效的早期检测策略的迫切需求，进一步研究评估miRNA在高风险群体中识别HBV相关肝癌的潜力是必要的。

本研究旨在评估循环miR-21-5p、miR-34a-5p和miR-30d-3p在越南HBV相关肝癌中的诊断潜力。通过分析这些miRNA的表达谱，我们希望为肝癌的更准确和非侵入性诊断方法的发展做出贡献。研究结果突显了miRNA作为早期检测工具的临床价值，并强调了它们在改善肝癌患者临床结果方面的潜力。

本研究采用横断面设计，结合回顾性和前瞻性数据收集方法。前瞻性数据收集时间为2023年5月10日至2024年11月30日，回顾性数据则来自2020年1月1日至2024年11月30日。每位患者被分配唯一的识别代码，以方便访问医院电子病历系统中的相关临床数据，并获得研究访问这些代码的许可。研究不包括任何未成年人。

本研究的样本量计算基于特异性，以确保在评估循环miRNA对肝癌的诊断性能时具有足够的精确度。计算遵循诊断准确性研究中估计比例的标准公式，结合了在最近miRNA面板分析中报告的肝硬化的特异性（Sp=89%）和HBV相关肝癌的特异性（Sp=75%），90%的置信水平（Za=1.65），以及允许的误差范围（w=0.06）。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）估计的亚洲人群中慢性肝病的患病率（1.6%），应用这些参数得出每组至少需要144名参与者，最终将每组人数调整为150人，以确保足够的统计效力并考虑潜在的数据丢失。慢性肝炎B组（CHB）和肝硬化组（LC）也使用了相同的样本量，以维持诊断类别之间的平衡。

总共招募了450名慢性HBV感染患者，并均分为三组：HBV相关肝癌（HBV-HCC，n=150）、HBV相关肝硬化（LC，n=150）和慢性肝炎B（CHB，n=150）。所有参与者都被分配唯一的ID代码，以确保数据链接和保密性。肝癌的诊断依据越南卫生部的指南（2019年7月7日第3310/Q?-BYT号决定）。在慢性HBV或肝硬化背景下，肝部病变≥1厘米并具有典型的动态影像特征，动脉期增强并门静脉或延迟洗脱的增强CT或MRI，足以作为诊断依据。在影像学不典型或AFP水平正常的情况下，通过超声引导的肝活检进行组织学确认。所有活检样本由两位经验丰富的病理学家独立审核。

慢性肝炎B的纳入标准包括HBsAg阳性及/或HBV DNA检测≥6个月，或HBsAg阳性且抗-HBc IgM阴性。肝硬化的诊断基于临床表现（如门脉高压、肝功能障碍）、影像学（超声）、生化检查、血液学和Fibroscan。肝癌的诊断依赖于特征性影像学发现（增强CT或MRI），无论AFP是否升高，并在必要时通过组织学确认。分期遵循BCLC系统。排除标准包括酒精性肝病、药物性肝损伤、HCV或HIV共感染、转移性肝癌以及使用免疫抑制或髓抑制治疗。

数据通过标准化临床表格收集，包括人口统计信息、临床病史、体格检查、实验室结果（如AST、ALT、胆红素、AFP、AFP-L3、PIVKA-II、HBV DNA）和影像学发现（肿瘤数量/大小、门静脉血栓形成、纤维化阶段）。肝功能和纤维化严重程度通过Child-Pugh、APRI和FIB-4评分评估。

用于肝癌组的血浆样本是从108军医中央医院回顾性收集的，而用于慢性肝炎B和肝硬化组的血浆样本则是从2020年至2024年在国家热带病医院招募的患者中前瞻性收集的。所有样本均按照相同的标准化流程处理：血液采集到EDTA管中，1小时内离心以分离血浆，并储存在-80℃直至RNA提取。为了减少预分析偏差，所有队列均采用统一的处理程序。

本研究遵循赫尔辛基宣言，并获得越南河内108临床医学与药学研究所的机构审查委员会批准（批准号：3092/H???）。所有前瞻性招募的参与者在充分解释研究目的和程序后，签署了书面知情同意书。

总RNA，包括miRNA部分，是从300μL血清中使用600μL TRIzol试剂提取的。提取后的RNA用DEPC处理的水重新悬浮。RNA的质量和纯度通过NanoDrop分光光度计（NanoDrop Technologies，美国威尔明顿）测量260/280nm的吸光度进行评估。逆转录过程中，使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（ThermoFisher Scientific，新加坡），按照制造商的协议将500ng总RNA转化为互补DNA（cDNA）。cDNA合成的茎环引物基于miRBase数据库（http://www.mirbase.org/）中的序列设计。引物设计通过在线miRNA引物设计工具（http://genomics.dote.hu:8080/mirnadesigntool/index.jsp）进行，并使用Oligo Analyzer软件验证所选引物的熔解温度。

逆转录后，cDNA用80μL DNase-和RNase-free DEPC处理的水稀释。miRNA的定量使用实时定量PCR（RT-qPCR）在Roche LightCycler 480 II系统上进行。每反应包含10μL SensiFAST? SYBR No-ROX试剂盒主混合液（Bioline，伦敦，英国），4.6μL cDNA，5pmol通用反向引物（GTGCAGGGTCCGAGGT）和5pmol特异正向引物。RT-qPCR程序包括初始预孵育95℃ 15分钟，随后进行45次扩增循环：变性95℃ 5秒，退火在miRNA特异性温度（详见S1表）10秒，延伸72℃ 10秒。在运行结束后进行熔解曲线分析以确认扩增产物的特异性（补充图S1）。

数据经过仔细的质量检查，只有表现出清晰单峰的样本才被包含在最终分析中。目标miRNA的相对表达水平使用比较Ct（ΔCt）方法确定，以miRNA-16作为归一化对照。表达变化按照之前描述的方法计算。miR-16-5p被选为归一化参考基因，因为它在HBV相关肝病患者的血浆样本中表现出稳定性和高丰度。先前研究表明，miR-16在不同肝病阶段（包括慢性肝炎B、肝硬化和肝癌）中表现出一致的表达。熔解曲线分析确认了miR-16和所有目标miRNA的尖锐单峰和最低背景。明显的峰分离进一步确认了引物特异性，且在阴性对照中未检测到扩增。

为了研究所选循环miRNA（miR-21-5p、miR-34a-5p和miR-30d-3p）在肝癌中的生物学作用，我们使用公开的生物信息学工具和数据库进行了计算机模拟分析。选择标准：候选miRNA通过综合文献回顾确定，使用PubMed、Google Scholar和Science Research数据库。纳入标准包括：（i）H指数>100；（ii）在肝癌组织或血清中与对照相比至少有2倍的差异表达；（iii）在PI3K/Akt、MAPK、TGF-β和Wnt/β-catenin等致癌信号通路中有验证的参与。基于这些标准，miR-21-5p、miR-34a-5p和miR-30d-3p被选为进一步分析，因为它们在肝癌中表现出一致的失调，并且其机制相关性得到了多项研究和计算资源（TargetScan、miRTarBase、UALCAN）的支持。

miR-21-5p和miR-34a-5p的预测和验证基因靶点从三个独立数据库（TargetScan v8.0、miRDB和miRTarBase）提取。在至少两个数据库中出现的基因被保留用于下游分析。这些基因集使用DAVID和KEGG通路工具进行富集分析。miR-21-5p靶向关键的致癌基因如PTEN、PDCD4和BCL2，这些是调节增殖和逃避凋亡的PI3K/Akt和MAPK通路的组成部分。miR-34a-5p，一种p53调控的肿瘤抑制因子，靶向CCND1、CDK6和SMAD4，从而在肝癌中促进细胞周期停滞和调节TGF-β信号。对于miR-30d-3p，尽管其在肝癌中缺乏广泛的实验验证靶点，但其表达谱通过UALCAN网络门户（http://ualcan.path.uab.edu）进行了分析。

所有统计分析均使用R版本4.3.2进行。连续变量用均值±标准差（SD）或中位数及四分位数范围（IQR：25th–75th百分位数）总结，而分类变量则用计数和百分比表示。两组间比较使用Mann–Whitney U检验，三组或更多组比较使用Kruskal-Wallis检验，根据数据分布决定。

为了评估循环miR-21-5p、miR-34a-5p和miR-30d-3p在区分肝癌与其他HBV相关状况（慢性肝炎B、肝硬化和非肝癌）中的诊断能力，我们开发了结合miRNA和简单协变量（年龄、性别和AFP）的广义线性模型（GLMs）。通过生成基于预测概率的受试者工作特征（ROC）曲线，使用曲线下面积（AUC）作为诊断性能的衡量标准。比较AUC值用于评估不同GLM模型的相对准确性。此外，使用Spearman秩相关系数探索miRNA表达水平与临床参数之间的关联。统计学意义定义为双侧P值<0.05。

在HCC与CHB的比较中，单miRNA模型调整了年龄和性别（GLM1–GLM3）表现出优秀的诊断性能，AUC值范围为0.90到0.92。结合三种miRNA的GLM7模型（miR-21-5p、miR-34a-5p和miR-30d-3p，加上年龄和性别）稍有提高，AUC值为0.92。重要的是，将AFP加入该模型（GLM8）显著提高了诊断性能，达到0.97，明显高于AFP单独模型（GLM9：AUC=0.86）。

在HCC与肝硬化的比较中，诊断性能较为温和。3-miRNA GLM7模型的AUC为0.75，而AFP单独模型的AUC为0.73。同样，将AFP加入3-miRNA模型（GLM8）提高了区分能力（AUC=0.84），证实了其在区分肝癌与肝硬化等临床挑战性情况中的补充价值。

在HCC与非肝癌（CHB + LC）的比较中，单miRNA模型和双miRNA组合模型产生了相似的诊断性能（0.82–0.83）。3-miRNA GLM7模型，结合年龄和性别，达到0.83的AUC，表明没有显著优势。然而，当加入AFP（GLM8）时，诊断准确性显著提高，达到0.91，明显高于AFP单独模型（GLM9：AUC=0.80）。

总体而言，结合三种miRNA（miR-21、miR-34a和miR-30d）与AFP的GLM模型在所有比较中表现出强且一致的诊断性能。这些结果支持了miRNA面板在提高肝癌检测准确性方面的价值，特别是在高风险人群中。

在临床应用中，将miRNA生物标志物与AFP结合为增强肝癌检测提供了一种有前景的方法，特别是在HBV感染人群中。血基miRNA检测方法微创且受益于循环miRNA的稳定性。值得注意的是，我们的研究显示miRNA表达水平不受肝酶波动的显著影响，支持其区分肝癌与非肿瘤性肝病（如慢性肝炎B或肝硬化）的潜力。这种独立于暂时性炎症的特性在监测环境中尤为重要。然而，重要的是要批判性地解释诊断性能。尽管我们的3-miRNA面板在区分肝癌与慢性肝炎B时达到了0.92的AUC，但在肝癌与肝硬化的比较中，其AUC较低（miRNA面板单独为0.75，结合AFP为0.84）。这些值反映了中等的区分能力，可能由于肝癌和肝硬化之间在生物学和临床特征上的重叠。这两种情况可能共享分子特征和影像学特征，这可能会限制生物标志物的特异性。此外，HBV相关肝病的异质性，包括不同纤维化阶段、病毒载量和宿主反应，增加了生物标志物性能的复杂性。

为了弥合研究与临床实践之间的差距，未来的研究应优先考虑miRNA测量协议的标准化，包括预分析处理、归一化策略和跨平台验证。将这些生物标志物纳入临床实践将受益于开发成本效益高的多重检测或点对点诊断，能够同时检测miR-21、miR-34a、miR-30d和AFP。此外，纵向队列研究对于评估这些miRNA特征对早期肝癌检测和治疗反应监测的预测价值至关重要，特别是在AFP阴性或肝硬化患者中。将miRNA谱与影像学方法和其他组学数据（如甲基化、蛋白质组学）整合可以增强HBV相关肝病的风险分层工具。高负担地区的政策制定者和医疗系统也应考虑投资miRNA为基础的监测策略，以提高肝癌的早期诊断和结果。

尽管有令人鼓舞的结果，但仍然存在一些限制。首先，miRNA的诊断性能受预分析变量的影响，包括样本来源（血浆vs血清）、归一化方法和检测平台（qRT-PCR vs数字PCR）。研究间的异质性仍然是标准化和跨研究比较的障碍。其次，尽管miRNA测试提供了高准确性，但其成本和技术需求可能限制其在低资源环境中的广泛应用，特别是在HBV感染率和肝癌负担较高的地区。第三，本研究的横断面设计限制了对miRNA表达与疾病进展之间时间关系的推论。纵向研究对于评估miRNA谱对高风险人群中肝癌发展的预测价值是必要的。