来自Xanthomonas orzyae的Hpa1蛋白的生物物理特性研究

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》：Biophysical characterization of Hpa1 protein from Xanthomonas orzyae

Xanthomonas oryzae pv. oryzae的hpa1蛋白克隆表达与结构稳定性分析，结合SDS-PAGE、CD光谱、ANS荧光和热稳定性实验，证实其α螺旋含量及pH依赖的稳定性特性，揭示无需完整天然构象即可激活植物抗病反应及促进生长的机制，为生物刺激剂开发提供新依据。

　　

Jaimini Patoliya | Khushali Thaker | Jahanvi Bajapai | Dhaval Patel | Nayan Jain | Prasant Kumar | Rushikesh Joshi

生物化学与法医学系，古吉拉特大学科学学院，艾哈迈达巴德 380009，印度

摘要

Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）是导致水稻细菌性枯萎病的病原体，它通过III型分泌系统（T3SS）分泌一系列效应蛋白，其中Hpa1等harpin蛋白是调节植物免疫的关键因子。与其他T3SS效应蛋白不同，Hpa1没有酶活性，而是作为一种生物刺激剂，促进植物的生长和防御反应。在本研究中，从Xoo BXO1菌株中克隆了hpa1基因，并成功地在E. coli Rosetta细胞中表达了该基因。重组蛋白通过Ni-NTA色谱法纯化，SDS-PAGE和Western blotting验证了其分子量（约16.5 kDa）。生物物理特性分析显示其主要为α螺旋结构。通过CD光谱法（使用GuHCl）和ANS荧光（使用GuHCl和尿素）评估了Hpa1的热稳定性和化学稳定性，结果表明其具有中等稳定性。pH依赖性稳定性研究表明，在pH 5时其结构最为稳定。TFE诱导的结构变化通过CD光谱法观察到，显示出浓度依赖性的α螺旋增强。通过四种方法评估了其热稳定性：SDS-PAGE、222 nm处的CD光谱、SYPRO Orange热位移测定以及在大豆（Nicotiana benthamiana）中的HR诱导活性。这些结果共同证实，Hpa1的天然构象对其功能并非必需。这些发现突显了其作为农业应用中蛋白质基生物刺激剂的潜力，以及作为研究内在无序但功能稳定蛋白质的模型的重要性。

引言

Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）是一种革兰氏阴性植物病原体，会导致水稻细菌性枯萎病，这是一种具有全球农业重要性的疾病。其致病性核心在于III型分泌系统（T3SS），这是一种类似注射器的分子装置，可将效应蛋白直接输送到宿主植物细胞中。这些效应蛋白通过操纵宿主细胞过程来促进细菌定殖并抑制免疫反应[1,2]。在T3SS效应蛋白中，harpin蛋白是一类独特的蛋白质，它们缺乏酶活性或DNA结合结构，但仍能引发强烈的植物防御反应，如过敏反应（HR）[3,4]、耐旱性[5]、系统获得性抗性（SAR）[6,7]，并诱导植物免疫途径[8]。首个harpin蛋白最初是从Erwinia amylovora中分离出来的[9]，随后在以下植物致病菌中发现了不同的harpin蛋白：Xanthomonas、Pseudomonas、Erwinia和Ralstonia[10],[11],[12],[13],[14],[15]。Harpin蛋白通常是富含甘氨酸的热稳定蛋白，能够穿透植物质膜并引发防御信号级联反应。

其中一种名为Hpa1的harpin蛋白由Xanthomonas oryzae pv. oryzae分泌，因其双重功能而受到越来越多的关注。Hpa1与其他含有延伸的卷曲螺旋α螺旋的harpin蛋白（如HrpZ和HrpN）不同。Hpa1体积较小，只有短N端螺旋和大部分无序区域，但仍具有HR诱导和促进生长的活性[16]。这种紧凑而灵活的结构使其与其他harpin蛋白区分开来。除了引发HR反应外，Hpa1还被报道能在田间条件下促进植物生长和提高作物产量，表明其具有超出传统植物防御作用的生物刺激效果[17],[18],[19]。这种双重功能使Hpa1成为harpin家族中的独特成员，在可持续农业和作物生物技术中具有巨大潜力。从结构上看，Hpa1缺乏典型的催化或芳香残基，而是作为一个模块化支架，与植物膜成分（如水通道蛋白）相互作用以启动防御反应[20],[21],[22]。先前的突变研究（特别是涉及N端区域的研究，例如D41A突变[18]）表明，Hpa1的不同区域负责不同的生物学效应，如HR和SAR，这表明其具有域特异性功能[19],[23],[24],[25]。像HpaG10–42片段这样的harpin蛋白在水稻抗病性和产量提升、植物开花以及寄生植物中表现出类似的双重作用，支持了这些蛋白质在田间应用中的广泛适用性[26]。

它们缺乏半胱氨酸残基，N端α螺旋区域形成的卷曲螺旋（CC）结构被认为赋予了harpin蛋白热稳定性[4,7,23]。然而，影响热稳定性的具体因素尚不清楚[18]。迄今为止，许多研究表明N端区域对于与植物质膜蛋白水通道蛋白的结合以及HR反应的引发至关重要。改变N端的α螺旋区域或卷曲螺旋区域可能会影响该蛋白的功能[23,25,27]。不过，蛋白质结构的丢失是否也会影响其功能仍有待阐明。HrpZ蛋白的结构已通过多种生物物理方法进行了广泛研究，明确了其吉布斯自由能和热稳定性[12,28,29]。然而，使用生物物理方法研究Hpa1结构特性的研究较少[18]。以往的研究主要集中在Hpa1触发免疫和促进植物生长的生物学活性上，但并未全面评估其结构和生物物理稳定性[18,23]。特别是，对Hpa1的折叠、构象灵活性以及热/化学稳定性的系统分析尚缺乏。为此，我们从Xoo BXO1菌株中克隆并表达了hpa1蛋白，并对其进行了详细的结构和功能分析。通过结合圆二色光谱（CD）光谱、基于ANS的荧光、热位移测定和植物生物测定，我们评估了Hpa1在不同环境条件下的稳定性。因此，这项工作扩展了之前的功能研究，首次提供了Hpa1的结构和稳定性综合分析，将其生物物理特性与其在作物保护和产量提升中的潜在用途联系起来。

质粒构建

获取了Xanthomonas oryzae pv. oryzae BXO1菌株，随后使用PrimeSTAR HS Premix（Takara-R040A）引物克隆了hpa1基因。引物序列分别为hpa1_F 5’ GTAGCTAGCATGAATTCTTTGAACACACA 3′ 和 hpa1_R 5’ AATAAGCTTTTACTGCATCGATGCGCTGT 3′。hpa1基因扩增的PCR条件如下：95°C预热10分钟变性，30个循环（95°C变性30秒，47°C至62°C（3°C梯度）退火30秒，72°C延伸30秒

Hpa1的克隆、表达和纯化

Hpa1蛋白由139个氨基酸组成，分子量为16.5 kDa，由一个420 bp的基因编码。补充图S1(a)显示了在62°C下hpa1基因的PCR扩增情况。hpa1_pET28a克隆通过基因特异性引物（补充图S1b）进行了PCR扩增验证，并通过Sanger测序（补充图S1c）进行了确认。

为了分析Hpa1的表达和溶解性，我们对E. coli Rosetta (DE3) 细胞裂解液中的可溶性和不可溶部分进行了检测

讨论

本研究全面探讨了Hpa1蛋白在不同物理化学条件下的结构动态和稳定性。以往的研究主要集中在Hpa1的功能结果上，如HR诱导、生长促进和田间产量提升，但没有对其结构或热力学稳定性进行详细评估。相比之下，我们的研究系统地整合了多种生物物理方法（CD、TSA、荧光等）

CRediT作者贡献声明

Jaimini Patoliya：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学设计、实验设计、数据分析、概念化。 Khushali Thaker：撰写——审稿与编辑、可视化、方法学设计、数据分析。 Jahanvi Bajapai：方法学设计、数据分析。 Dhaval Patel：验证、监督、方法学设计。 Nayan Jain：验证、监督、资源提供。 Prasant Kumar：撰写——审稿与编辑、验证、数据分析、概念化。

资助

本研究未获得任何资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢印度古吉拉特州的SHODH计划（高质量研究发展计划）为Jaimini Patoliya和Khushali Thaker提供了资助。