一种用于评估抗菌效力和生物膜特异性活性的半固态体外生物膜模型

《Biofilm》：A Semi-Solid In Vitro Biofilm Model for Evaluating Antimicrobial Potency and Biofilm-Specific Activity

生物膜模型；抗生素敏感性；空间限制；克林霉素；化感物质；药物协同作用；半固体培养；耐药性；生物膜形成；扩散限制

　　生物膜在慢性细菌感染中扮演着至关重要的角色，而现有的抗菌药物在应对日益严重的抗微生物耐药性问题上显得力不从心。为了推动新型抗菌药物的研发，亟需更贴近体内环境的生物膜模型，以更准确地评估药物的抗菌和抗生物膜活性。传统体外生物膜模型，如广泛应用的最小生物膜消除浓度（MBEC）实验，依赖于液体培养系统，但这些系统难以再现组织相关生物膜的结构和生理特征。因此，研究人员开发了一种名为“改良克伦模型”（Modified Crone’s Model, MCM）的半固体生物膜模型，该模型将细菌嵌入类似于软组织的琼脂基质中，以模拟更接近实际感染环境的条件。

MCM的构建基于对传统模型局限性的深入理解。液体培养系统虽然在某些情况下方便使用，但它们无法有效复制宿主组织的物理结构、空间限制以及扩散限制，这可能导致实验结果与实际体内情况存在偏差。MCM通过将细菌置于半固体琼脂中，能够更真实地反映生物膜在体内环境中所经历的物理和化学条件。这种模型的建立不仅提高了生物膜的生长一致性，还增强了实验结果的可比性和可重复性，为抗菌药物的筛选提供了更加可靠的平台。

在实验过程中，MCM被用于评估多种治疗剂的抗菌活性，包括已知药物和新型化合物。研究人员发现，两种不饱和脂肪酸——顺式-2-癸烯酸（C2DA）和顺式-11-甲基-2-十二烯酸（DSF）——具有显著的抗菌增效作用，并且表现出内在的抗生物膜活性，这一点在传统的微量肉汤稀释法（MIC）实验中是无法检测到的。此外，MCM还展示了其在模拟生物膜在猪骨组织和植入物表面生长时的适用性，实验结果表明，在这些不同的生长环境中，生物膜对药物的敏感性没有显著差异。这说明MCM不仅适用于常规的生物膜研究，还能广泛应用于与组织相关的复杂感染模型中。

为了进一步验证MCM的有效性，研究人员还对不同成熟时间的生物膜进行了比较。他们发现，当保持抗菌药物暴露时间不变时，成熟时间较长的生物膜对药物的敏感性更高。例如，与1天成熟的生物膜相比，14天成熟的生物膜在相同药物暴露时间下显示出更显著的细菌减少效果。这表明，生物膜的成熟时间对其对药物的反应具有重要影响。此外，延长抗菌药物的暴露时间也能够显著提高细菌的死亡率，这可能是因为更长时间的药物作用有助于克服生物膜中复杂的结构和代谢异质性。

MCM的另一个重要特点是其在抗菌药物筛选中的灵活性。研究人员不仅评估了单一药物的效果，还测试了多种药物组合的协同作用。结果显示，某些化合物如C2DA、DSF和氨基甲酸乙酯（amylmetacresol）在与克林霉素联合使用时，能够显著降低生物膜中的菌落数。这种协同效应的发现，不仅为开发新的抗生物膜治疗策略提供了理论依据，也揭示了在药物筛选过程中，采用合适的生物膜模型对于准确评估药物效果的重要性。

在实验方法方面，MCM的构建和使用涉及一系列精细的操作步骤。首先，将0.5%的琼脂LB培养基固化在试管中，然后加入稀释后的细菌过夜培养液，使其干燥后，再在温热条件下添加第二层琼脂LB培养基，以形成一个连续的琼脂基质。随后，加入液体LB培养基并培养96小时，此时细菌会在琼脂插件的中间形成一个可见的生物膜平面。接下来，将感兴趣的药物加入液体培养基中，继续培养72小时。最后，通过机械破坏将试管内容物均质化，并进行菌落形成单位（CFU）计数。这一流程确保了实验的可重复性和数据的准确性。

为了进一步验证MCM的生理相关性，研究人员还利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对不同环境下的生物膜进行了可视化和比较。结果显示，MCM中的生物膜在大小和形态上与体内生物膜相似，但与传统的液体培养生物膜存在显著差异。这表明，MCM能够更真实地反映体内生物膜的生长条件，从而为抗菌药物的筛选提供更可靠的依据。

此外，研究人员还对多种抗菌药物在MCM中的抗菌效果进行了比较。结果显示，不同药物在MCM中的抗菌效果排名与传统液态培养系统存在显著差异。例如，DSF在MIC实验中未表现出抗菌活性，但在MCM中却显示出强大的抗生物膜能力。这一发现强调了选择适合的生物膜模型对于准确评估药物效果的重要性，尤其是在开发针对生物膜的新型治疗策略时。

在讨论部分，研究人员指出，尽管MCM是一个简化模型，但它在模拟体内生物膜的物理和化学条件方面具有显著优势。MCM能够稳定地再现生物膜的大小、氧和营养梯度，以及代谢异质性，这些因素在体内感染中至关重要。然而，MCM并未完全复制体内复杂的生物环境，如血浆中的蛋白质、免疫细胞和动态机械力等。这些因素的缺失可能会影响生物膜的生理特性，但同时也保证了实验的可重复性和可扩展性。

为了进一步提高模型的适用性，研究人员还探讨了MCM在不同宿主环境中的表现。他们发现，无论是嵌入在琼脂中还是与骨组织或植入物表面结合，生物膜对药物的敏感性没有显著差异。这表明，MCM能够有效地模拟多种感染环境，为抗菌药物的开发和评估提供了广泛的应用前景。

综上所述，MCM作为一种新型的半固体生物膜模型，不仅在结构和生理特性上更接近体内条件，还在抗菌药物的筛选和评估中展现出更高的准确性和可靠性。其简单、可重复的设计使其成为一种理想的预临床研究工具，有助于推动新型抗菌药物的研发和应用。未来的研究可以进一步验证MCM在不同细菌种类和复杂感染模型中的适用性，以拓展其在临床研究中的应用范围。