三种源自轮胎橡胶的污染物对斑马鱼幼体产生的亚致死效应的评估

《Epidemics》：Assessment of the sub-lethal effects induced by three tire rubber-derived contaminants on zebrafish larvae

亚致死效应下轮胎橡胶衍生污染物对斑马鱼胚胎的氧化应激与蛋白质组学响应研究。测试了DPG、6PPD及其代谢产物6PPD-q在500 ng/L浓度下对斑马鱼胚胎的毒性，发现DPG和6PPD-q通过激活抗氧化酶（SOD、EROD、GST）和调控8-9个蛋白质表达影响生物标志物，但未显著改变存活率与形态。BRI指数显示6PPD-q和DPG毒性高于6PPD。蛋白质组学分析发现DPG和6PPD-q导致H2A.V、H2B3等组蛋白表达下调，提示DNA修复和表观遗传机制受损。该研究强调轮胎添加剂的混合毒性需进一步探索，建议关注抗氧化系统及蛋白质修饰的长期生态风险。

　　本研究聚焦于三种关键的轮胎橡胶衍生污染物（TRDCs），这些物质在轮胎生产过程中作为硫化剂和抗氧化剂使用，分别是1,3-二苯基胍（DPG）、N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺（6PPD）及其氧化产物6PPD-醌（6PPD-q）。研究在500 ng/L的浓度下评估了这些TRDCs对斑马鱼幼鱼（Danio rerio）的亚致死效应，时间范围从受精后0小时到120小时。研究通过广泛的生物标志物、蛋白质组学分析以及用于炎症检测的成像技术，对这些污染物的影响进行了系统分析。尽管在所有实验组中未观察到显著的生存率或形态学变化，但DPG暴露导致了最广泛的生物标志物响应，显著诱导了超氧化物歧化酶（SOD）、乙氧基玫瑰苯胺-O-脱乙基酶（EROD）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的活性。为了获得TRDCs的毒性等级，研究基于使用的生物标志物构建了生物标志物响应指数（BRI），表明6PPD-q和DPG的毒性高于6PPD。蛋白质组学分析也显示，DPG处理导致8种蛋白质的调控，6PPD-q导致7种，而6PPD仅影响4种。此外，研究还指出，为了更全面地理解轮胎相关污染物对水生生态系统的潜在毒性，还需要考虑TRDC混合物的其他证据。

轮胎的快速增长导致了大量废弃轮胎（ELTs）的产生，这对废物管理提出了重大挑战。轮胎的老化主要是由于与沥青界面的摩擦产生特定类型的碎片，称为轮胎道路磨损颗粒（TRWPs）。一旦废弃，ELTs会被加工成（微）橡胶颗粒（粉末和颗粒），用于道路建设和草坪场地等。这些行为构成了环境中的轮胎碎片及其相关化学物质的来源，包括制造和交通活动产生的化学物质。此外，在轮胎制造过程中，为了提高耐用性、安全性和驾驶特性，会加入各种添加剂，如硫化剂DPG，它加速了轮胎制造过程中聚合物的交联，并增强了橡胶的物理和机械性能。抗氧化剂6PPD也被广泛用于防止热和氧化降解，从而延长轮胎的使用寿命。这些因素突显了对轮胎及其颗粒生态影响的深入理解的必要性，特别是在其生命周期中可能释放的有害物质。值得注意的是，城市径流已被发现会导致成年银色鲑鱼（Oncorhynchus kisutch）的死亡，环境分析研究指出6PPD-q是罪魁祸首，它是6PPD的氧化产物。这些物质被定义为轮胎橡胶衍生污染物（TRDCs），已被检测到存在于空气、灰尘和水中。例如，在香港的城市径流中，6PPD和6PPD-q的浓度分别为0.21至2.71 μg/L和0.21至2.43 μg/L，而在美国西雅图和洛杉矶的道路上，6PPD-q的浓度分别为0.8至19 μg/L和4.1至6.1 μg/L。另一方面，DPG在加拿大的多伦多河雨水中被检测到浓度为0.52 μg/L，而在澳大利亚和美国的河流中，其浓度分别为13-1079 ng/L和5-540 ng/L。欧洲河流中DPG的中位浓度为41 ng/L，峰值可达140 ng/L。

这些TRDCs对淡水物种的环境风险引发了广泛关注。体外研究表明，DPG及其氯化产物在1和5 μM浓度下暴露24小时后，可能产生基因毒性效应，表现为磷酸化组蛋白H2AX水平的升高。同样，斑马鱼胚胎在1000和3000 ng/L的DPG浓度下暴露120小时后，出现了运动模式改变和线粒体呼吸链复合体I的抑制。在甲壳类动物Moina macrocopa中，DPG在0.5 mg/L浓度下暴露时，导致了繁殖效应和多代的持续氧化应激。至于6PPD-q，它对特定水生生物表现出高度毒性，例如在24小时内95 ng/L的浓度下即可对银色鲑鱼产生致命影响，其24小时的半数致死浓度（LC50）值为41 ng/L。然而，尽管银色鲑鱼对6PPD-q表现出高度敏感性，但该化合物在其他模式生物中表现出不同的急性毒性水平，表明其效应可能具有物种特异性。例如，Hiki和Yamamoto（2022）对三种鲑科鱼类进行了96小时测试，结果显示6PPD-q对Salvelinus leucomaenis pluvius具有致命毒性，其24小时的LC50为0.51 μg/L，而在其他两种鱼类中，即使在环境相关浓度下也未观察到致命效应。此外，6PPD和6PPD-q对斑马鱼的暴露还导致了行为障碍和心脏毒性，且在环境相关浓度下呈现出剂量依赖效应，其24小时的LC50为308.67 μg/L。在12小时暴露中，6PPD和6PPD-q在浓度范围50至1000 μg/L下，导致成年斑马鱼出现活动减少、运动无序、类似焦虑的行为以及蛋白质失衡。

尽管已有大量证据表明轮胎颗粒对水生环境的潜在危害，但其添加剂的慢性影响仍缺乏系统研究，尤其是在淡水生物中。在此背景下，Magni等人（2024）发现ELT水悬浮液在斑马鱼幼鱼中的主要作用机制与芳香族和含氮化合物的代谢途径有关。由于某些TRDCs同时含有芳香族和含氮基团，我们的假设是这些化学物质可能在轮胎颗粒整体毒性中发挥重要作用。因此，本研究旨在评估关键TRDCs在环境相关浓度（500 ng/L）下对斑马鱼幼鱼从受精后0小时到120小时的亚致死效应。选择该浓度是基于已有数据，这些数据表明这些污染物在水生基质中的存在。具体而言，500 ng/L代表了在这些基质中可能合理检测到的中间环境浓度。此外，Magni等人（2022、2024）在斑马鱼中测试的ELT水悬浮液中，DPG的浓度低于1000 ng/L，而6PPD的浓度低于10 ng/L（在100 mg/L的储备液中）。因此，我们决定使用不超过之前测试悬浮液中可能存在的浓度水平，以更好地比较本研究中观察到的效果与之前的研究结果，从而验证本研究的假设。为了填补与之前TRDCs在斑马鱼中的研究知识空白，我们通过不同生物组织层次的生物标志物电池评估了亚致死效应。此外，考虑到之前研究中ELT水悬浮液对蛋白质调控表现出显著影响，我们还进行了蛋白质组学分析。具体来说，由于异源物质暴露可能导致氧化应激的增加，我们评估了抗氧化酶SOD的活性以及活性氧（ROS）的水平。为了评估与氧化应激相关的潜在炎症诱导，我们使用了转基因斑马鱼tg(mpx:GFP)，这些斑马鱼的中性粒细胞在常染色体中表达荧光蛋白，使得可以观察中性粒细胞的行为。作为其他细胞应激的终点，我们还测量了EROD和GST的活性，以评估暴露生物的解毒能力。此外，考虑到酶防御可能不足以保护生物免受异源物质的影响，我们评估了脂质、DNA和蛋白质的潜在损伤，分别通过脂质过氧化（LPO）、碱性DNA沉淀法（APA）和淀粉样蛋白的测量。最后一个终点，即评估蛋白质聚集的淀粉样蛋白检测，连接了生物标志物和无凝胶蛋白质组学，后者作为一种高通量方法，用于研究选定污染物对代谢途径的影响。此外，我们评估了乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性，作为神经毒性的标志。为了减少所用终点的内在变异性，所有生物标志物随后被整合到生物标志物响应指数（BRI）中。

研究中，TRDCs的浓度在1 mg/L的Milli Q?溶液中接近标称值，但在500 ng/L的暴露介质中，6PPD的浓度在暴露过程中显著降低，可能由于其在水中的不稳定性或在Petri皿表面的吸附。相比之下，6PPD-q和DPG的浓度在暴露过程中变化较小，表明它们在水中的稳定性较高。此外，6PPD-q在暴露过程中表现出轻微的降解，而DPG的浓度在暴露结束时有所增加，这与其高度持久的特性一致。值得注意的是，DPG在DMSO对照组中也出现了微量污染，其浓度在暴露过程中略有上升，但由于处理浓度远高于污染水平，因此不会对观察到的生物学响应产生负面影响。

在生物标志物和蛋白质组学分析中，观察到TRDCs对斑马鱼幼鱼产生了一些分子响应。例如，ROS的产生在暴露于6PPD-q的幼鱼中显著减少，这表明该化学物质可能影响幼鱼的氧化状态。相反，暴露于DPG的幼鱼中ROS水平显著增加，表明可能诱导氧化应激。同时，SOD活性在DPG暴露的幼鱼中显著增加，约为对照组的66%。这与Tripeptidyl-肽酶1在DPG暴露幼鱼中的上调有关，该酶参与神经退行性疾病，可能与氧化状态的变化相关。然而，SOD的活性足以在暴露期间抵消ROS的增加，因此LPO未显示出显著的脂质损伤。此外，炎症反应的评估未发现显著差异，因为未观察到中性粒细胞迁移的特定途径。这些结果部分与之前的研究不一致，这些研究涉及更高浓度的TRDCs，表明在不同浓度下，TRDCs对生物的影响可能存在差异。

对于GST，其活性在暴露于DPG的幼鱼中显著增加，这与之前的研究一致，表明DPG可能通过与芳烃受体（AhR）的相互作用，影响幼鱼的解毒能力。此外，EROD活性在DPG暴露的幼鱼中也显著增加，进一步支持其解毒能力的增强。这些结果与Magni等人（2024）的研究一致，他们发现ELT颗粒在斑马鱼幼鱼中显著调控了GST和EROD。这种酶活性的增加可能与ELT颗粒在水中释放的复杂混合物有关，包括DPG。在此背景下，之前的研究将EROD活性的增加与多环芳烃（PAHs）和重金属的关联，这些物质通常在轮胎中被检测到。因此，DPG对EROD的特定影响可能与其与AhR的相互作用有关。

在神经毒性方面，暴露于6PPD-q的幼鱼中AChE活性显著增加，这与Tripeptidyl-肽酶1的上调一致，该酶与神经退行性疾病有关。这一神经毒性效应与之前的研究结果一致，表明在较低浓度下，6PPD-q可能影响神经递质水平，进而影响行为表现。此外，6PPD-q在高浓度下的暴露还导致了多巴胺和γ-氨基丁酸（GABA）水平的升高，进一步支持其对神经系统的影响。

在基因毒性方面，未观察到暴露组与对照组之间的显著差异。这一结果与之前的研究不一致，这些研究在更高浓度下观察到了6PPD-q和DPG的基因毒性效应。然而，由于本研究中的浓度较低，可能无法检测到显著的基因毒性，因此需要进一步研究以确认这些污染物的基因毒性潜力。此外，由于缺乏能够诱导强基因毒性反应的正对照组，无法得出明确结论。

综上所述，尽管在500 ng/L的浓度下，未观察到显著的生存率或形态学变化，但DPG暴露导致了最广泛的生物标志物响应，表明其可能对水生生态系统造成潜在的长期生态风险。这些发现强调了进一步研究的重要性，以填补关于这些添加剂的知识空白，特别是DPG和6PPD-q，以及轮胎携带的其他大量污染物。通过深入研究这些TRDCs及其混合物对环境的影响，有助于制定有效的策略，以减轻这些新兴污染物带来的风险，并确保轮胎相关污染物的可持续管理。